上皮-间质转化的连续过程

◎Litian Soon，Anthong Tachtsidis，Scmdra Fok，Elizabeth D.Witliams，Donald F.Newgreen，Erik W.Thompson

4.1.1 EMT与细胞迁移:侵袭癌具备的胚胎发育必要步骤

上皮-间质转化(EMT)的概念源于对发育过程相关事件的研究，特别是细胞迁移开始前［1］。EMT与细胞迁移最初是由已故的Elizabeth Hay等联系在一起并逐渐被广为接受［2，3］。研究最深入的例子之一是神经外胚层上皮产生迁徙性神经嵴间质细胞［4］(图4-1)，这些细胞继续发育形成自主神经和感觉神经系统。甚至在更早期的原肠胚形成阶段即出现上皮外胚层的初级间质(第一次EMT)，形成高度可移动的细胞，对身体发育至关重要［1］(图4-2A)。其他上皮细胞更多的EMT发生于神经嵴EMT之后，产生形成肌肉、骨骼和结缔组织所需的细胞(图4-2B)。这种细胞的可塑性是胚胎发育的基础，且其调节主要发生在转录水平。各种E-钙黏蛋白(及其他钙黏蛋白)的转录抑制因子如Snail (Snail-1)、Slug(Snail-2)、Twist、Zebl(3EF1)、Zeb2(SIP)和E47/E12可调控发育系统中的EMT［5］。

正常细胞种系分化比最初想象的更易变，而细胞转变被认为是成体组织自我稳态的主要机制［6］。发育过程中的EMT和癌细胞迁移侵犯局部组织具有惊人的相似性，提示后者是一种病理性EMT［7-9］。两者的相似之处已经延伸到分子表达和基因调控水平，尽管必须承认大多数证据来自肿瘤细胞系的体外模型研究［10］。由于一直缺少人类或动物肿瘤的直接证据，这加剧了在癌侵袭中是否真的存在EMT的争议［11］。然而最近采用EMT相关基因调控元件驱动的标记物体内研究，提供更强的相关性证据提示癌组织中癌细胞侵袭时确实发生了EMT［12，13］。这已经在功能上得到了证实，如当EMT的基因表达导致细胞自杀时，可减少动物模型的肿瘤转移［12］。

最近以Affymetrix芯片对两组大样本的人乳腺癌细胞系(分别由34［14］和51［15］个细胞系组成)进行的全基因组表达谱研究，为肿瘤细胞系存在EMT样特征提供了证据［16］。同时提出了一种观点，认为肿瘤干细胞(而非大量肿瘤细胞)是影响肿瘤生长与播散的重要异常因素。这和之前报道相一致，即迁移肿瘤干细胞存在于胃癌侵袭前沿的具有EMT特性的细胞群中［17］。通过一系列基因表达研究发现EMT与乳腺癌干细胞(BCSC)的转录构成之间具有共性，干细胞的概念已经与肿瘤EMT的概念相互融合［18］。人类乳腺上皮细胞经EMT诱导后确可呈现出BCSC样特性［19］。从病因学的观点来看，小部分癌细胞中发生的生物学过程，在整个疾病表型中可能起到了关键作用。癌转移可能源于单细胞循环，而EMT对于这些细胞的转移性播散可能起着关键作用，其中在原发瘤中只有极小部分的肿瘤细胞表达EMT标记，这就是BCSC生物学在最近研究中被广为关注的原因［20］。

图4-1 神经嵴EMT

注: 在神经嵴示例的横截面图表中显示EMT的特征性改变。神经上皮细胞(蓝色)转换为间质神经嵴细胞(粉红色)与极性和中间丝的变化(IF)，此时细胞与细胞粘连减少，并调节细胞的ECM粘连。此外，如纤维蛋白溶解酶原激活剂(PA)和金属蛋白酶(MMP)等蛋白酶表达上调，而ECM的合成与降解均受到调节。

图4-2 发育EMT

注: (A)在多细胞动物中最先发生的EMT是原肠胚形成，如横截面所示。上部的外胚层上皮细胞平均移动，然后在中线处内陷并进行EMT。由此产生的间质细胞(红色)形成一个新的无序中间层，同时细胞从侧面独自移动。(B)原肠胚形成之后，间质细胞聚集形成新的上皮细胞(中胚层)，并经过进一步的EMT和MET的复合模式。本图展示了发育过程中的几个不同阶段。

4.1.2 EMT程度:从极端到不完全

任何极端生物现象都值得研究;这也适用于EMT及其直接导致的细胞迁移和侵袭。从这些研究可以得出，EMT和迁移的确切特征包括(图4-3):①细胞与细胞间黏附下调，尤其是因为缺少典型钙黏蛋白介导的细胞连接。这导致新的间充质细胞与其上皮细胞分离。②细胞骨架的重组导致上皮细胞丧失顶-底极性(以F-肌动蛋白的变化为例)，获得移动(前-后)极性，导致上皮结构发生退化，并且可能导致细胞从其所在位点迁移出去。③细胞外基质(ECM)分子和调节细胞-ECM细胞表面黏附分子(特别是整合素)的基因表达发生改变，使得细胞可对基膜与细胞间隙ECM进行重排，并由此产生对后者的牵引。④编码细胞外蛋白酶的基因上调，如纤溶酶原激活因子和多种基质金属蛋白酶(MMPs)，可能促使细胞清除细胞与细胞间的黏附分子，使之能够穿过基膜ECM，便于渗透到致密的间质ECM。

在对哺乳动物或鸟类胚胎的原肠胚形成或神经嵴迁移以及体外培养的某些癌细胞中，这些特性更加显著，间质细胞被认为是独立行动的。然而，当对鸟类神经嵴细胞的迁移等更极端的EMT和迁移事件进行延时成像(time-lapse imaging)动态研究时，发现细胞具有较强的交往互动以支配其行为。神经嵴细胞迁移的时候，几乎总是在与其他神经嵴细胞互动，形成“头-尾”链(“head to tail”chains)。只要对细胞间的联系进行数分钟的检测，即可发现相邻细胞间存在频繁交换。当把周围的细胞移除后，神经嵴细胞则停止定向持续移动，表现为极少的真正迁移或侵袭［21，22］。

还可能存在不那么极端的状况，只出现部分EMT的特征或出现的特征没有极端状况那么明显。一个有关发育的例子是青蛙原肠胚形成。这个过程与哺乳动物和鸟类的原肠胚形成类似，不同的是在青蛙原肠胚形成过程中，原肠胚细胞并不是像一堆看起来杂乱无章的细胞一样迁移，而是呈成片扩散，且前缘细胞表现出前-后极性和运动特化(motile specialization)，但其后面的细胞仍维持上皮样细胞-细胞粘连。这种片状扩散类似于上皮细胞的损伤愈合。还发现细胞集团运动或集合运动的其他许多例子［23］，如血管生成时像连贯线一样延伸的细胞，肾、乳腺和肺组织形态发生时的小管形成，果蝇边缘细胞球的边缘细胞运动;在早期脊椎动物的心脏形态发生过程中细胞团的运动，以及在体外实验中许多癌细胞在体外实验中的各种行为等。适用于描述这些多样化情况的术语尚未商定，但它们与EMT具有许多明显共性，这样的“上皮”细胞被定义为“自由的”、“活化的”、“杂合的”、“化生的”或“部分EMT”的“不稳定”细胞。

4.1.3 间质-上皮转化:回到未来

在发育过程中，EMT和细胞迁移后常有迁移细胞停止迁移并聚集。实时跟踪某些谱系的细胞，会发现EMT与间质-上皮转化(MET)存在多次循环。下面是发育过程中该循环的经典例子:上皮外胚层在原肠胚形成的过程中生成原间质(通过EMT)(图4-2A)，该原间质形成被称为体节前的体节板、间质中胚层和侧板中胚层的上皮层(通过MET)。体节板中胚层重组成莲座状上皮体节后形成间质生骨节(另一个EMT)，侧板中胚层(称为胚体壁和胚脏壁)也分散到间充质(EMT)，而间质中胚层分散(EMT)，但之后上皮形成肾小管(MET)(图4-2B)。发生EMT的细胞并非不可逆地维持在这个状态，而是通过MET来恢复，这种观念已经在癌转移研究中得到认可。

图4-3 混合/亚稳态表型

注: 如上部面板所示，亚稳态细胞可能拥有使细胞在上皮细胞和间质表型之间切换的功能。这种细胞亚群可能是允许转移的各个步骤完成的关键。亚细胞可以选择的优势包括:①Rac模式的切换，Rac涉及细胞骨架和中心黏着重排;②β-连环蛋白的定位，β-连环蛋白对加强细胞与细胞的黏附非常重要，它可以将细胞内钙黏蛋白尾部固定到细胞骨架结构;③上皮和间质标记共表达，如波形蛋白(一个众所周知的间质细胞内的中间丝蛋白)和上皮细胞角蛋白。在特定情况下，通过转换以上指标，促使上皮细胞或间质表型的产生。EMP:上皮-间质的可塑性;MET:间质-上皮转化;EMT:上皮-间质转化。

4.1.4 肿瘤与EMT的概念

在基因和分子表达方面的研究进展深化了对EMT和培养体系中相关功能变化的大量研究［24-28］，越来越多的研究提示原发瘤中EMT标记具有预测预后的意义，其中包括波形蛋白(vimentin; 尽管尚存争议，一般认为是由间质起源细胞表达)等EMT标记对乳腺癌预后意义等研究［29］。最近已报道包括波形蛋白在内的一组EMT类标记与侵袭性更高的基底性乳腺癌亚型有关［30］。其他研究也提示EMT驱动因子如上面提到的Snail(Snail-1)、Slug(Snail-2)、Zebl( ＜5EF1)和Twist等E-钙黏蛋白抑制物对预后的影响［31-40］。

这样的研究不局限于乳腺癌。Baumgart等［41］在不同分期和分级的膀胱肿瘤临床样品中，研究多个EMT相关标记的预后意义，发现E-钙黏蛋白的丢失，同时伴有β-连环蛋白和斑珠蛋白(plakoglobin)的减少和胞质重定位，与肿瘤较晚分期和分级有关。这项研究还证实，在一些研究的肿瘤样本中存在N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达上调。此外，更多研究还探索了E-钙黏蛋白表达及其物理、功能和过程的相关分子(如moesin、zyxin、a-连环蛋白、p53、RB和INK4A)［42-47］。其中观察了E-钙黏蛋白在临床标本中的表达及其预后价值，但其结果不同。因此，尽管大量数据涉及一些肿瘤进展中EMT相关过程，但缺少确切的EMT标记。包括我们自己在内的许多实验室正在努力寻找新的标记，更好识别乳腺癌及其他癌症具有EMT倾向。

许多研究把EMT过程和假定的EMT轴(EMTaxis)的可变性与实际转移过程联系起来。源于上皮的癌细胞成功转移需要完成一系列特定步骤，包括从上皮集落的分离、周围基质的降解、通过基膜迁移和侵袭、侵入并在循环中存活、外渗进入转移部位、存活成为微转移病灶，最后生长成为可见的转移灶［48］。为了完成这些复杂步骤，癌细胞在不同时间，甚至在同一时间表现出间质和上皮样等不同属性［3，26，28］。EMT调节因子确实可改变细胞周期体系，并通过这些手段可能延长残留癌细胞的生存期［49］。在癌基因被抑制后，EMT调节分子Snail-1被证实与残留癌细胞形成局部复发有关［50］。

肿瘤细胞的间质衍生化表现出许多有利于转移的属性，如从群体分离成为单个细胞、迁移和侵袭潜力增强，在悬浮条件中的生存能力和对化疗的抗凋亡能力增强。间质性状的持续表达将有助于肿瘤细胞在转移部位的外渗和生存。越来越多的证据提示循环肿瘤细胞(CTC)和微转移病灶可能具有EMT特性。长期以来，人们一直公认CTC上皮特异性细胞角蛋白的表达下调［15］，最近的研究也表明源自乳腺癌微转移病灶的细胞系稳定表达间质细胞的标记波形蛋白［51］。

在转移过程中EMT除了可促进癌细胞的迁移，还能增强癌细胞对失巢凋亡的抵抗［52］、生存力［49］、基因组不稳定性［53］和化疗耐药性［54］，从而作为肿瘤生物学中一个潜在的理想靶标。总之，通过发育学EMT通路，固着的上皮癌细胞转化为具有迁移侵袭能力和转移潜能、对失巢凋亡和化疗耐受的癌细胞［55］。

4.1.5 肿瘤与MET的概念

MET概念也发现在肿瘤领域，由此认为肿瘤转移的产生是与类似EMT修复的EMT有关，其导致最初的从原发瘤部位逃离的情况。这与原发瘤和转移灶的公认相似性是一致的［56-60］。一个明显的例子是转移性大肠癌，远处转移灶的形态发生和分化模式与结肠上皮极为相似［17］。我们实验室的研究表明，转移性T24/TSU-Prl膀胱癌细胞系的高转移株要比其低转移株表达更多的上皮标记(钙黏蛋白及角蛋白)［59，61］。此外，在前列腺癌转移到肝脏时，癌细胞表达上皮标记E-钙黏蛋白水平上调，前列腺癌细胞和肝细胞的共培养也可出现类似的E-钙黏蛋白水平上调［62］。此外，在前列腺癌细胞的上皮和间质表型相关表皮生长因子(EGF)受体亚型驱动的荧光标记清楚地表明，在原发瘤和肺转移灶中均存在上皮-间质表型的可塑性。这提示上皮和间质状态之间的转换能力既可有效促进癌细胞离开原发肿瘤，也有利于形成远处转移灶(图4-3)。事实上，对EMT衍生的细胞群进行仔细分析表明，混合或转移性表型比纯间质化表型更为常见。我们在用EGF诱导EMT的PMC42LA人乳腺癌细胞体系中发现上皮和间质标记的共表达(稍后讨论)，这些细胞同时表达波形蛋白和细胞角蛋白［63］以及上皮细胞黏附因子(Ep CAM)。

最近，这种上皮-间质可变性的混合表型在肿瘤领域中已被公认［25］，并被称为亚稳态表型(metastable phenotype)［64］或活化上皮细胞［65］。其他学者也发现这种混合状态［66］，这可部分解释为何在临床样本难以发现EMT［11］。间质性状的获得可能是瞬时的，可能会发生在上皮细胞基因表达背景下，还可能在转移过程中发生逆转。

4.1.6 EMT和MET相关分子

证实完全EMT以及部分或不太明显EMT间连续性的最可靠证据是发育和肿瘤之间共有的基因表达和分子功能。EMT是影响黏附分子及其相关信号通路变化的高潮，并以此促进发育中的原肠胚形成或肿瘤转移等过程中的细胞迁移［67］。例如E-钙黏蛋白的下调，这可能是受体酪氨酸激酶(RTK)激活上调MAPK或Wnt信号通路活性的结果，这又反过来阻止GSKβ对MAPK活性的抑制作用［26，28］。这两种途径都使Snail-1和Snail-2的活性增加，阻断E-钙黏蛋白的转录［68-70］。作为EMT的其他变化包括可降低黏附接点的组装和稳定性的RTK活性，以及通过转化生长因子β(TGF-β)诱导细胞骨架分子解聚，从而破坏细胞与细胞紧密连接［28］。与肿瘤相关EMT及正常EMT的共同信号分子见表4-1。

表4-1 正常EMT与肿瘤相关EMT的功能比较

续表

注: 本表对涉及发育和癌症EMT的相关分子进行了总结。表中描述的大部分信号通路参与调节EMT细胞与细胞间黏附组件。然而，它们调节细胞的其他方面能力(如细胞内构架组织、ECM黏附、其他EMT分子的激活/抑制)时，可以同时调节两方面的功能，或者与表中列出的功能相互关联。表中列出的分子及其相互作用的信号转导通路是不完整的，所述的许多通路和相关分子之间存在显著的交叉。此外，细胞背景和信号通路的激活/抑制和表达的性质将决定分子具有的功能。

4.1.7 EMT:细胞黏附与细胞骨架分子

原型上皮钙黏蛋白(E-钙黏蛋白)通过黏附接点影响多数成熟上皮细胞之间的同型附着力［71］。各种类型钙黏蛋白及其表达水平显著影响细胞的特性。例如，E-钙黏蛋白(钙黏蛋白-1)、N-钙黏蛋白(钙黏蛋白-2)、R-钙黏蛋白(钙黏蛋白-4) 和K-钙黏蛋白(钙黏蛋白-6) 等钙黏蛋白在肾形成过程中表达。有趣的是，E-钙黏蛋白在肾间黏充质诱导后首次发现，而且E-钙黏蛋白抗体封闭并不影响MET［72］。这些结果表明存在其他类型钙黏蛋白(或其他类型黏附分子)在肾形成时诱导出上皮表型。K-钙黏蛋白-/-和R-钙黏蛋白-/-型小鼠都明显表现出MET缺陷［73］。N-钙黏蛋白可以刺激FGF受体，后者进一步又上调MMP的活性［74］。这包含一系列作用，如其他钙黏蛋白分子胞外结构域的剪切。例如， MMP-3或MMP-9可剪切E-钙黏蛋白的胞外结构域［75］。剪切的碎片与完整的钙黏蛋白竞争性地结合到相邻细胞钙黏蛋白上，降低细胞与细胞间的黏附并促进EMT。这对于神经形成过程中细胞重排以形成发育结构很重要。对于癌症，这可能是促进转移、利于癌细胞从原发瘤迁移的一种机制。连环蛋白是钙黏蛋白作用的关键分子，它们可调节钙黏蛋白聚集和钙黏蛋白-肌动蛋白细胞骨架连接的强度。此外，p120ctn通过提高钙黏蛋白的稳定性来调节其周转［76］。

虽然多数有关钙黏蛋白作用的研究都关注EMT，但钙黏蛋白很可能还参与继发部位有结合力肿瘤的生成。对任何钙黏蛋白，细胞和组织环境在决定其功能方面起着重要作用。已发现N-钙黏蛋白在包括心肌的多种细胞类型中可导致有力的细胞黏附［77］，可促进血管生成过程中的内皮细胞等其他类型细胞的移动和播散［78］。N-钙黏蛋白通过不同的途径产生迁移信号［79］。

4.1.8 EMT参与细胞移行

典型的上皮细胞是具备顶部和基底表面极化的细胞层［10］。间质细胞一般既不表现出刻板的结构，也没有紧密的细胞间黏附，当运动时表现出一定的前缘极性。间质迁移不同于上皮细胞运动，是一层细胞整块移动。间质迁移相对更加动态可变，没有什么规律。上皮细胞在EMT的过程中，减弱细胞连接(黏附连接、紧密连接和桥粒)并使其获得运动能力。

4.1.9 间质性和阿米巴样迁移及其相互转变

单个肿瘤细胞运动被描述为间质性或阿米巴样运动［80］，不同状态的转换是从上皮到间质再到阿米巴样运动［81］。这些状态在一定程度上可相互转换，取决于其基因表达和细胞的微环境。任何特定的肿瘤或肿瘤细胞系均具有一定程度的异质性，这个特征正渐被认识和研究。在单细胞水平研究时，可以明显看到细胞系是由类间质型和阿米巴样细胞组成［82］。目前还不清楚各亚群在肿瘤进展过程中的相关作用及其在肿瘤治疗中的意义。

在细胞间质性迁移时，细胞突向前延伸，其后方拉出胶原纤维，在运动周期中这个过程与黏附和细胞收缩紧密相关。间质性迁移依赖Rac的活性和蛋白酶的分泌，但不依赖于ROCK介导的肌动球蛋白收缩。NEDD9和DOCK3作为Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)可激活Rac，促进间质性迁移。与其下游效应分子WAVE2相呼应，Rac还通过减少肌动球蛋白收缩力来抑制阿米巴样运动［83］。若蛋白酶抑制剂存在时，间质细胞可以转换为阿米巴样迁移，并继续侵入基质。

而阿米巴样迁移需要Rho和ROCK调节肌动球蛋白收缩，但蛋白酶是非必需的，因为通过细胞收缩和凝胶推进，细胞具有穿过基质筛的能力［84］。阿米巴细胞通过Rho激酶介导激活ARH GAP22(一种导致Rac失活的Rac GAP)来抑制间质性运动［83］。可以通过表达活化型cdc42将阿米巴样细胞向间质迁移表型转换［85］，这些细胞现在呈现一个更狭长的形态，而且需要蛋白酶来实现侵袭。

虽然cdc42被认为是阿米巴样和间质性迁移所必需的，其下游效应分子则有更特定的角色。例如，作为cdc42的GEF，DOC10是阿米巴样迁移的必需物。DOC10的缺失导致从阿米巴样到间质性迁移的转换，减少肌球蛋白轻链磷酸化，并增强Rac的活化［85］。其效应分子NWASP和PAK也有助于保持阿米巴样表型。然而，阻断cdc42可抑制间质细胞的表型，这表明尽管cdc42对阿米巴样和间质性迁移都是非常重要的，不同的效应分子可能在功能上区分这两种迁移模式。

阿米巴样运动有两种代表形式，即出泡、收缩介导模式或类似白细胞中发现的以突起为中心的运动模式。在迁移过程中的出泡比较小，以半球形膜的形式突出于细胞外周(图4-4)。发生在皮层肌动蛋白区的大水泡易破损，使细胞质外流和细胞膜(PM)扩展，形成滤泡［84，86］。这些结构直径约2μm，且是短暂存在，约1分钟即被缩回到细胞膜。细胞外活化最初导致细胞膜区域肌动蛋白的不稳定或解聚并产生流体静压，然后驱动细胞的细胞质和细胞膜形成滤泡。滤泡扩张被随后的肌动蛋白的聚合所抑制，肌球蛋白被输送到这个区域和随后Rho-ROCK收缩导致滤泡回缩［86］。虽然已知滤泡与细胞迁移有关，但其功能尚不清楚。对滤泡是如何形成和抑制的进一步了解，可能有助于进一步明确其功能。

最初体外研究神经嵴细胞迁移时，人们注意到初始运动包括表面出泡，后来进入一个更加快速的间质性运动模式。出泡迁移的体内证据较少，Trinkaus在克鲤鱼(Fundulus)早期发育时的外包运动中做过描述［87］。

白细胞表现出一种与癌细胞的出泡和收缩等完全不同的阿米巴样迁移方式。细胞收缩用于向前推动细胞核。但这种机制因抑制肌球蛋白而被破坏时，细胞仍以较慢速度继续横穿胶原蛋白基质。当降低胶原蛋白凝胶的浓度以增加基质孔隙的大小时，肌球蛋白受抑制的细胞能够达到和对照细胞同样的瞬时速度峰值。相比之下，干扰引起细胞突起形成的肌动蛋白抑制剂latrunculin B能显著降低运动速度，不受基质浓度约束。这表明，决定迁移速度的主要机制是前伸运动。在特定条件下，即细胞无法单独靠前伸力通过胶原，那么就要依靠细胞收缩来帮助迁移［88］。此外，这种运动在三维凝胶中不依赖整合素，这又与依赖突出介导机制的成纤维细胞和间质性肿瘤细胞的间质迁移不同。在白细胞中，不对基质施加拉力细胞突起就向前伸出，并且后方胞体的细胞收缩模式不规则。在细胞突起阶段，胞体被动地向前牵拉，迁移包括在时间和空间上不同步的前突和收缩阶段［88］。

4.1.10 肿瘤细胞的间质性迁移和阿米巴样迁移及其异质性

在EMT中，细胞的自分泌信号可引起化学驱动行为(为增强的随机运动)，导致肿瘤细胞离开原发肿瘤［89］。一旦进入循环系统，肿瘤细胞可以播散到特定器官，这一过程被称为“归巢”(homing)，趋化作用(定向运动)在其中发挥重要作用［90］。化学趋动性(chemokinesis)是指在广泛分布的可溶性因子存在条件下的细胞运动，包括转变行为的速度、频率或幅度变化。趋化性(chemotaxis)是指细胞或有机体的运动性，其运动方向取决于扩散因子的梯度。Kohn等人［91］发现癌细胞对生长因子表现出既有趋化作用，又有化学趋动性的特征。

图4-4 迁移模式

注: 发生EMT后细胞转化为阿米巴样或间质性肿瘤细胞，这种细胞能以特有方式在二维和三维环境内运动。阿米巴样细胞在片状伪足内表达瞬态和薄弱的复合物，而间质样细胞能产生与基质牢固接触的黏着斑。阿米巴细胞的趋化和化学趋动性效率都很高，但间质细胞只能在梯度条件下有效运动(如在Boyden小室测试)。在时间推移成像实验中，因为有在不同方向产生新的片状伪足的倾向，阿米巴样细胞可以往随机方向移动。另一方面，根据细胞的极性，间质细胞持续在一个方向移动。当在三维基质和肿瘤中接种，阿米巴样细胞通过皮层肌动蛋白收缩穿过基质孔隙，这个过程取决于ROCK。MMP和RAC不需要阿米巴样三维迁移。间质细胞的产生在基质为细胞运动扩出一条路径MMP，但细胞收缩不是必需的。

细胞迁移一般采用两种方法进行评估:第一种方法使用Boyden小室，可对运动能力进行终点评估;第二种使用活细胞成像技术，记录细胞的运动动态过程［92-95］。在Boyden小室内，细胞接种到上室，采用多孔膜将包含生长因子的下室分开。膜两侧形成生长因子梯度，刺激细胞通过毛孔从顶部迁移到底部(趋化作用)。孔的大小要利于主动迁移(8～12μm)。当膜的两边没有渐变梯度时，例如两边的生长因子浓度相同，细胞则通过化学运动性迁移到下室。

利用Boyden小室，通过趋化(有梯度)或化学运动性(无梯度)可将异质性肿瘤细胞分离为具有不同迁移特性的两个亚群［82］，收集迁移到下室的细胞并使其增殖。有趣的是，当进行迁移测试时，化学趋动性条件下分离的细胞(KINE细胞)表现出和原始细胞群相同效率的化学运动和趋化能力;趋化条件下分离的细胞(Con细胞)只显示趋化能力，而没有化学趋动性。在侵袭实验中发现KINE细胞比Con细胞的侵袭性要强很多。利用活细胞成像检测进一步描述亚群的特征。在被血清刺激后，KINE细胞的移动是随机的，而Con细胞则坚持在一个方向移动。这进一步印证了随机移动的细胞具有较弱的极性，而定向运动细胞具备更强极化的细胞前后结构(front-to-back architecture)等观点。为了从内部肌动蛋白细胞结构和外部黏附接点间的关系了解细胞极性，使用鬼笔环肽结合物(phalloidin conjugates)和桩蛋白(paxillin)抗体对肌动蛋白和黏附接点进行共染色实验。KINE细胞中的肌动蛋白染色表现为更加圆润的形态，具有广泛的细胞边缘皱裂膜和较少的弹性纤维;Con细胞更多表现出极化，具有鲜明的前部和尾部两端。KINE细胞的黏附接点不显著，在片状伪足内更多的发生一过性局灶性复合物;而Con细胞则被细胞边缘的焦点黏附固定，肌动蛋白压力纤维终止的地方也存在黏附接点(图4-4)。

这些结果表明，具备化学趋动和趋化能力的两种肺癌细胞亚群，在极性、粘连、形态和二维迁移等方面分别表现出阿米巴样和间质的特征(图4-4)。这是首次来自研究细胞迁移的两种不同方法(Boyden小室和活细胞成像)的数据取得一致。更重要的是，对两种迁移模式的认识有助于进一步深入了解细胞的可变特性如何影响不同研究方法的权重。

细胞迁移的两种模式，对癌症的病因及治疗方面也有重要的影响。例如，在异质性癌细胞群中，采用MMP抑制剂治疗将使间质样细胞的行为更阿米巴样;采用ROCK抑制剂将阻止阿米巴样细胞迁移，而对间质样细胞的迁移没有影响。因为大多数肿瘤的细胞组成是异质性的，这个因素在选择合适的治疗方案抑制迁移和转移时很重要，并且需要同时抑制这两种模式的细胞迁移。

4.1.11 当前常用的EMT和迁移研究系统

(1) 神经嵴迁移

对神经嵴EMT和迁移的分子调控分析证明，许多体内特征可以用二维培养法在体外复制［96］。通过二维培养，人们发现可以通过瞬态钙黏蛋白失活或通过抑制a PKC或Rho和ROCK来操控细胞骨架，从而触发EMT和细胞移动。还发现在迁移路径上需要依赖特定的黏附基质，特别是ECM分子纤连蛋白。这个过程是由一组整合素受体介导的，而且ECM黏附分子的种类也是多样化和复杂化的，这样细胞需要为应对复杂变化的ECM微环境进行精密的迁徙变化。“条纹”法可以用来检测这种多底物的选择方式。此外，排斥区排斥力的反向引导机制已被认为是所有发育细胞和轴突迁移研究的基本纲领，并由此鉴定了第一个ECM排斥分子，同时还发现通过细胞-细胞接触(“运动接触抑制”的对立面)驱动神经嵴细胞的运动。由此揭示了促使神经上皮细胞成为神经嵴细胞，并确定其EMT及引导其迁移的生长因子信号和表达的转录因子。在体外观察的许多数据现在已经在体内通过现代成像系统和分子遗传摄影技术被证实［97］，在体内研究也逐渐发现分子控制的复杂性［98，99］。

(2) 13762NF系统

要在细胞培养中研究阿米巴样和间质性细胞的转移机制，我们和其他人采用的是从同一动物模型13762NF乳腺癌的原发瘤(MTC，间质性)及其肺转移灶(MTLn3，阿米巴样)分离得到的细胞系［100］。MTLn3细胞保留了高转移潜能，而MTC细胞的转移潜能较低。当注射到Fisher344大鼠乳腺脂肪垫时，MTLn3细胞4周内在所有腋窝淋巴结和肺中形成转移灶，而MTC细胞注射后5周只在同侧淋巴结转移［101］。这种转移差异不是增殖倍增时间差异造成的，因为14小时培养两个细胞株的倍增时间相同。转移的差异更像是EGF受体的表达水平不同所致。每个MTLn3细胞表达EFG受体达55000个，而MTC细胞EGF受体阴性［102］。在MTC细胞中人为表达与MTLn3细胞相同数量的(人)EGF受体后，其趋化性更强，并表现出更高的肺转移能力［103］。因此，阿米巴样MTLn3细胞和采自同一原发瘤的间质样MTC表现出非常不同的转移潜能，代表了在体外和体内一个重要的研究模型。这些细胞的上皮/间质状态尚未见报道，我们的实验室正在对其进行研究。

(3) PMC42模型

我们已经开发出一个全新的应用人类乳腺癌细胞系PMC42研究EGF诱导EMT的模型系统［26，63，104，105］。母代的PMC42细胞在最初被鉴定时表现为类似干细胞的性质［106-109］，它们显现出间质特征(100%波形蛋白阳性)，并可被EGF诱导出更极端的EMT［26］。在墨尔本迪肯大学的Leigh Ackland，开发的上皮亚系可在三维基质胶培养中形成腺泡状结构，这些结构受到泌乳激素刺激时可产生牛乳蛋白［110］;当立体种植在基质胶集群时，在外周细胞可产生肌上皮标记［104，105］。PMC42-LA细胞受到EGF刺激时也可表达EMT标记［26］。用乳腺癌相关成纤维细胞选择性分泌因子处理基质胶立体培养的PMC42-LA时，这些标记的表达水平较用正常乳腺成纤维细胞分泌因子处理后更高［104］。因此，在BCSC行为的背景下，PMC42系统表现出一系列EMT不同进展阶段。我们已研究PMC42亲代细胞，并发现间质和阿米巴样亚群的存在，后者只占一小部分［16，26］。两种形态类型都可以有效地入侵一个三维胶原基质，但圆形(阿米巴样)细胞的速度更快。在相同的实验培养物中，间质和阿米巴样细胞分别采用集团和个别方式侵袭(未发表数据)。

(4) MDA-MB-468模型

MDA-MB-468细胞具有一个基底A表型，提示为管腔/基底混合属性［34］。最近发现其可经EGF发生EMT［111］。虽然主要是上皮细胞和E-钙黏蛋白阳性［35］，培养基上小部分细胞(约5%)为波形蛋白阳性，并具备中等的侵袭力［37，38］。已有报道称MDA-MB-468有自发性肺微转移(图4-1)，从肺微转移(468LN细胞)中分离的GFP标记MDA-MB-468细胞显示EMT的迹象(纺锤状形态，细胞增生)，虽然其在体内原发性肿瘤的形态与亲代MDA-468-GFP细胞相似［112］。基因中的DNA甲基化改变最近在468LN细胞中被证明与EMT和细胞迁移相关［113］。

(5) TSU-Pr1/T24模型

我们已经使用人类TSU-PRL(T24)膀胱癌细胞系开发出转移能力逐步递增的系列膀胱癌细胞系。选用TSU-Pr1亚系经骨腔内接种后可增强其骨转移能力［61］，从亲代细胞系(TSU-Prl)到TSU-PRL-B1(Bl)，直到最具侵略性的细胞系TSU-Prl-B2(B2)，其转移能力显著增强;全身接种后转移增加，伴随着EMTD表型(体外迁移、侵袭、集落形成的减少)和分子特征(上皮角蛋白、钙黏蛋白和膜相关β-连环蛋白增加，波形蛋白和肌动蛋白骨架下降)增强。

4.1.12 结论

在发现EMT是癌发生过程中的一个转化事件的早期阶段，EMT被描述为终点功能来研究。随着研究的进一步深入，我们逐渐明确这类转化并非像最初认为的那样完整和持久。在发展过程中，过渡状态中富于流动性的例子比比皆是，这是细胞对其微环境发生正常反应的一部分。

在肿瘤生物学中目前某些被认为是不寻常的现象，如显示上皮和间质标记的杂合细胞，也许是常态。肿瘤干细胞的存在和不断产生的从上皮到间质和阿米巴样细胞的次末级超晶胞可以部分解释在体内和体外肿瘤细胞群的异质性现象。当从二维移植到三维环境或动物模型时，这些细胞可以保持各自的状态;但在某些情况下，它们可发生间质-上皮转换(MET)，或从间质转换到阿米巴样状态(MAT)。在三维基质中上皮层迁移或队列迁移期间，前缘细胞呈现间质样性状，而尾随后面的贴壁细胞则保持上皮样。

这些范例对肿瘤发展和治疗的意义在于其是对肿瘤细胞反复无常性质的新认识，将会促使发明针对这种可塑性的新的防治方法。但是，对促使从良性到侵入性并最终形成转移癌的机制仍然难以捉摸。对这些机制的更深入了解，将为肿瘤诊断和治疗提供更多希望。

(郑燕译，钦伦秀审校)

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