失巢凋亡与衰老

◎Wen Liu，Kounosuke Watabe

4.2.1 凋亡:肿瘤进展中的关键力量

在20世纪70年代初，Fidler和他的同事们的开创性工作表明，肿瘤转移是一个非常低效的过程，进入循环系统的肿瘤细胞不到0.01%能够生存并定植(colonization)于远处器官［1］，多数从原发癌脱离的肿瘤细胞在遭遇到诱导细胞凋亡、衰老和免疫监视等人体天然防御屏障后即死亡。即使肿瘤细胞能够幸存并到达转移器官，往往也会休眠或衰老，它们的生长受到器官组织微环境条件的显著约束。

细胞凋亡是脊椎动物最常见的细胞程序化死亡形式，在过去10年中已被广泛研究，通常认为它是一个负相调控癌症发展的重要机制。最近的证据强烈支持一种观点，即细胞凋亡也作为一种防护体系，用来阻止肿瘤细胞的播散和转移。Inbal和他的研究小组利用肺癌细胞克隆发现，抑制促凋亡分子DAPK的表达可促进肿瘤转移进程［2］。另一方面，Del Bufalo等证明抗凋亡的Bcl-2高表达可显著提高人乳腺癌细胞的转移潜能［3］。此外，Glinsky等的出色研究在小鼠模型中证明细胞的凋亡倾向和转移潜能之间呈负相关［4，5］。因此，肿瘤的转移潜能越大，抗凋亡能力越强，促进凋亡或抗凋亡关键因子对肿瘤细胞转移的整体效率有显著影响(图4-5)。

研究已经证实，细胞凋亡是调节肿瘤转移效率的关键决定因素之一，主要调控肿瘤转移级联过程中的3个关键步骤(图4-5)。首先，当原发肿瘤细胞从细胞外基质(ECM)分离，就触发了一种特殊形式的细胞凋亡，称为“失巢凋亡”(anoikis)。在这个过程中，当肿瘤细胞脱落并破坏细胞-细胞锚定时，另一种形式的细胞凋亡——“无定形凋亡”(amorphosis)也被激活，最终导致细胞骨架结构的损失。这两种方式是人体天然存在的，通过清除那些外部入侵细胞来保障多细胞物种正确的解剖学分布，而那些入侵细胞在一定程度上则像转移性癌细胞一样。因此，肿瘤转移细胞必须要抵抗失巢凋亡和无定形凋亡，才能完成转移的最初步骤。其次，肿瘤细胞通过内渗进入血流之后，多数单个肿瘤细胞被宿主的免疫监视或机械应力破坏而死亡。但是，肿瘤细胞可产生一系列对策来抵抗免疫监视诱导的细胞凋亡，包括过量表达抗凋亡分子(如Bcl-2、FLIPL/S、生存蛋白)和直接干扰穿孔素/颗粒酶细胞毒性途径。最后，通过形成微转移灶并在继发器官生存的过程被称作定植。这对肿瘤细胞是最困难的一步，它们特别容易在这个阶段凋亡，因为成功的定植需要肿瘤细胞和宿主组织基质间的合作。肿瘤细胞在继发部位诱导许可信号，这种信号可能会影响宿主基质细胞，使宿主分泌利于肿瘤细胞生存和生长的因子(如生长因子、趋化因子和蛋白酶)。因此，这种基质-肿瘤细胞的相互作用决定了转移肿瘤细胞的命运，即死亡还是成功定植。具备血管生成能力是肿瘤细胞获得良好微环境的另一个障碍。由于细胞凋亡和增殖之间的平衡，未能诱导足够的血管生成，会导致肿瘤细胞衰老或休眠。

图4-5 转移级联过程中的凋亡、失巢凋亡和衰老

4.2.2 参与肿瘤转移过程的促凋亡和抗凋亡因子

细胞凋亡对组织内环境的稳定和发育等生理作用非常重要，因此细胞凋亡过程必须经过严格调控［6］。通常情况下，由凋亡导致的细胞死亡是由一系列监控细胞内、外环境的因子控制的，最终激活一种被称为caspases的特殊半胱氨酸蛋白酶家族［7］。迄今，已发现两种不同的主要途径:①由死亡受体CD95(也称为Fas)或肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员启动的“外部(死亡受体)途径”;②应对营养匮乏、细胞与细胞接触的丧失，以及化疗或放疗所造成的DNA损伤等诱发的细胞应激“内部(线粒体)途径”(图4-6)。虽然两个途径是由不同的刺激诱发，并通过不同的初始活化剂进行，但是两者之间存在关联。许多调节因子包括Bcl-2家族蛋白、p53、Ras和凋亡蛋白抑制因子(IAP)，参与了这两个依赖于caspases的细胞凋亡途径。这些细胞凋亡调节因子的突变、丢失或改变已被证明会影响肿瘤的进展和转移。

Bcl-2家族蛋白通过调节线粒体外膜渗透作用，对内部途径的调控起关键作用，从而调节抗凋亡(Bcl-2、Bcl-x L和Bcl-w)和促凋亡(Bax和BH3-only)［8，9］。一些证据表明，转移性肿瘤细胞的抗凋亡能力与这些凋亡调节因子的突变或功能障碍有关。与低转移性MDA-MB-468细胞系相比，高转移性MDA-MB-435人癌细胞的抗凋亡能力与Bcl-2特别是Bcl-xL的表达增加以及促凋亡基因 Bax水平下降有关［10］。

此外，内源性Bcl-2的过度表达已被证明与多种人类和小鼠的癌细胞进展为转移表型有关［11，12］。在其他高转移癌细胞中，这些细胞凋亡调控蛋白表达的失调是否增强了抗凋亡能力，尚有待进一步阐明。然而一个有趣的问题是，这些细胞凋亡抑制剂的表达是否可减少转移过程中细胞对凋亡刺激的敏感性。有人认为细胞凋亡易感性的降低利于转移性肿瘤细胞克服那些“易受攻击点”(将在后面讨论)。一些研究确实已经证明调控Bcl-2可影响整体转移效率［13，14］。例如，乳腺癌细胞中异位表达Bcl-2后，可显著增加其通过静脉注射或肌肉注射进入裸鼠体内肺转移的数量［3］。

图4-6 内源性和外源性凋亡途径

有趣的是，Martin等的研究发现Bcl-2的过表达能使永生化的乳腺上皮细胞避免发生失巢凋亡和变形凋亡，从而提高其转移能力，而不影响原发瘤的生长、细胞迁移或侵袭能力［15，16］。他们还确定了Bcl-x L是抗变形肿瘤细胞中骨架依赖性细胞死亡的主要抑制因子和转移增强因子［17］。研究还发现Bcl-x L过度表达与乳腺癌患者淋巴结转移增加和肿瘤侵袭性增强有关［18］，并已经证明Bcl-xL能增加远处转移，而不影响原发肿瘤的形成［19］。最近发现maspin——一个具有独特转移抑制活性的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白家族的成员，可通过调节Bcl-2家族蛋白抑制原发瘤的生长和转移［20，21］。因此，Bcl-2可作为一个潜在的抗肿瘤转移的治疗靶标。不过Bcl-2阻碍转移的确切分子机制仍有待进一步阐明。

肿瘤抑制基因p53可以刺激如Bax、BH3-only蛋白质BAD(Bcl-2细胞死亡受体拮抗剂)、Noxa和Puma等Bcl-2家族特殊成员的转录，从而引起如细胞色素C和Smac等凋亡诱导剂的释放［22-24］。虽然在60%以上的人类原发性肿瘤中常存在p53基因突变或缺失，但是在肿瘤转移进程中，p53基因突变发挥多大作用尚未确定［25］。作为细胞凋亡调节因子和肿瘤抑制基因，p53缺失在整体上可保护细胞不发生凋亡，从而增加了转移的概率。在临床上已发现p53功能丧失与可转移的增强、肿瘤复发和生存率低有关［26，27］。近期对1196个胃癌样本的研究发现，伴有低水平的细胞凋亡、高水平Bcl-2和p53基因突变的早期胃癌更可能发生转移［28］。此外，Nikiforov和他的同事发现，p53基因失活利于体内循环中肿瘤细胞的生存，从而促进实验性转移［29］。释放一氧化氮(NO)被认为是对转移形成的天然防御，因为它可通过诱导细胞凋亡从循环系统中清除转移性肿瘤细胞［30-32］。然而，有p53基因突变的肿瘤细胞被证明可耐受NO［33-35］，尽管目前还不清楚在循环系统p53究竟如何诱导肿瘤细胞凋亡。

IAP是新发现的一类蛋白，它可直接抑制内、外凋亡途径的最终效应器caspase3，因而被认为很有希望成为独特的治疗靶点［36，37］。IAP包括caspase抑制剂X-连锁凋亡抑制因子(XIAP)和生存素(SVV)，这些蛋白在许多类型癌症中都有高表达。SVV尤其与肿瘤侵袭性、预后较差、复发率高和治疗耐受性增强等相关，这表明它可能在转移中发挥作用［38-40］。IAP表达的增加似乎通过减少肿瘤细胞对凋亡刺激的敏感性来促进转移，这可能不仅有利于肿瘤细胞生存，还有利于转移过程中肿瘤细胞的侵袭和血管生成等其他行为。研究表明，XIAP的过度表达可增强循环中转移性人前列腺癌细胞的抗失巢凋亡能力［41］。同样，最近的几项研究表明，SVV可增强侵袭肿瘤细胞在细胞因子/生长因子、黏附分子和蛋白酶刺激下的生存能力［42］。有趣的是，还发现XIAP和SVV的表达增加是由血管内皮生长因子(VEGF)引起的，反过来通过诱导血管生成促进肿瘤转移［43，44］。这些因素都涉及血管生成，可作为抗肿瘤转移的潜在治疗靶点。

Ras是一个小GTP结合蛋白，在增殖、凋亡、细胞骨架组织以及其他重要生物过程的信号转导中发挥重要作用。Ras家族成员包括h-ras、n-ras、k-ras和它们的病毒同源物(v-ras)［45］。通常情况下，Ras家族成员通过PI3K/Akt通路抑制细胞凋亡，下调JNK和p38促进细胞的存活［46］。目前尚不清楚Ras在肿瘤转移中如何调节凋亡，一种可能是其增加转移性肿瘤细胞总体的抗凋亡能力。也有人推测Ras通过影响增殖和凋亡信号，在微转移的形成阶段起作用。Varghese等已经证明h-ras基因突变通过将早期微转移发生过程中细胞凋亡/增殖平衡向增殖偏移来增加肿瘤转移潜能［47］。Liao和他的同事进一步证实了这个想法，他们发现h-ras基因反义治疗可减少肺转移，增加循环中肿瘤细胞的死亡率。同样，一个显负性突变的c-k-ras基因可有效减少胰腺癌肝转移中的转移灶数目［48，49］。已知Ras可以阻碍TGF-β抑制肿瘤生长的能力［50，51］。另一方面，激活的Ras和TGF-β协同作用可促进极化h-ras转化乳腺上皮细胞模型的转移［52］。因此，Ras既可通过直接调节细胞凋亡途径，也可通过影响其他因素(如TGF-β)来提高肿瘤转移效率。

4.2.3 凋亡敏感性决定了转移性肿瘤细胞的脆弱性

肿瘤转移在细胞水平上是一个“全或无”的过程，转移的效率取决于转移过程中肿瘤细胞个体成功通过每一个连续步骤的能力。然而，在临床上即使在高转移群体的肿瘤细胞多数也难以完成整个转移过程，而且细胞凋亡是转移过程各个步骤中消除肿瘤细胞的重要机制。因此，通过降低凋亡刺激的敏感性获得生存优势，是肿瘤细胞摆脱原发瘤和进入转移级联过程后自我保护的共同策略。

多年来，采用体内电视显微镜技术和“细胞计数”技术对肿瘤转移过程效率的定量研究已逐渐揭示肿瘤转移过程中的“限速”步骤的确易受细胞凋亡的影响。令人惊讶的是，Ann Chambers研究小组的系列实验研究已证明，血道转移的最初阶段(包括肿瘤细胞脱落进入血管系统、在循环中生存并能在微循环初期捕获后幸存)具有较高的效率，而且多数肿瘤细胞在这些早期步骤中不会损耗［53-55］。例如，通过肠系膜上静脉注射的B16F1黑色素瘤细胞在注射90分钟后，超过85%的细胞出现在肝脏中，甚至在注射3天后仍有超过80%的细胞出现在肝脏中［53］，后来Cameron等使用B16F10黑色素瘤细胞的研究也获得类似的结果，他们发现98%注入细胞在注射后1小时在肺部出现，注射1天和3天后仍有83%和73%的细胞在肺部出现［54］。

在乳腺癌模型中也观察到类似的结果，高转移D2A1细胞株和转移能力较差的D2.0R细胞，在注射后3天仍有80%的细胞存活［55］。使用体内视频显微镜观察到的证据还表明，癌细胞和微循环内皮细胞之间的相互作用是转移生长的决定因素，而且与内皮细胞释放活性氧(NO、O2和H2O2)相关的细胞凋亡可促进转移性肿瘤细胞在早期被消除［56，57］。

研究证明肺微循环捕获肿瘤细胞后，在局部诱导释放NO，诱发肿瘤细胞凋亡、抑制肺转移。然而，因为在这个阶段多数细胞并未丢失，转移负荷似乎取决于在继发部位损失的细胞比例。在之前提到过的同一项研究中，Luzzi等发现在注射3天之内，到达肝脏的B16F1黑色素瘤细胞只损失了不到20%，而13天时损失了注入细胞的2/3［53］。此外还发现，肝脏内的B16F1细胞只有1/4开始形成微转移灶，并且只有1%成功形成肉眼可见的转移。在转移的这些阶段的肿瘤细胞凋亡导致了大部分细胞的消除。

在另一项研究中发现，细胞凋亡的高峰期发生在孤立转移性肿瘤细胞和微转移丧失之时［55］。从微转移到肉眼转移的进展取决于两个因素:癌细胞的生长和通过至关重要的血管生成来供血。未能满足这两个要求则会导致形成“休眠”的微转移，在此过程中，细胞凋亡和增殖达到平衡，没有肿瘤净增长。因此，“休眠肿瘤”的激活很可能与打破肿瘤细胞群体凋亡与增殖平衡的机制有关。然后问题出现了，如什么是休眠肿瘤细胞的更明智选择，是加强增殖还是减少细胞凋亡? 一些研究表明，细胞通过降低细胞凋亡而不是增加增殖来退出休眠并开始生长［58-60］。对控制转移生长的血管生成抑制剂的研究也表明，在这个阶段增加细胞凋亡的关键作用。因此，通过控制转移过程中易受攻击的步骤，凋亡细胞损失可导致整体转移效率低下，这些步骤包括在微循环中捕获及其与内皮细胞相互作用捕获、在继发部位单个细胞的生存、微转移生长的起始和完成等。

4.2.4 失巢凋亡在肿瘤转移中发挥主要作用

ECM是由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖组成的动态复杂的网络，锚定细胞，并为细胞的增殖、迁移、分化和生存提供信号［61］(图4-7)。无论在体外还是体内，细胞与基质间的相互作用被破坏后即可触发失巢凋亡，也被称为ECM依赖性细胞凋亡［62，63］。因此，在缺乏正常的ECM成分时，转移性肿瘤细胞为了生存必须克服这个关键步骤，因为渗入循环和渗出进入继发器官的肿瘤细胞要么离开基质，要么暴露于外来的基质成分中。

一系列的实验结果表明抗失巢凋亡可导致肿瘤细胞的转移潜能增加。上皮-间质转化(EMT)被认为是肿瘤转移的最初步骤，原发肿瘤细胞重新调整与ECM的相互作用并获得逃避失巢凋亡的能力。在这个过程中，肿瘤细胞中许多与失巢凋亡相关的基因表达水平会下调。这些基因包括生长因子［如TGF-β和胰岛素样生长因子(IGF)-1)］、转录因子(如Smads和Snail)、细胞与ECM黏附分子［整合素、CD44、焦点粘连激酶(FAK)和ECM蛋白］、细胞-细胞黏附分子(E-钙黏蛋白)、胞外蛋白酶基质金属蛋白酶(MMPs)和窖蛋白-1(caveolin，Cav-1)。尤其神经营养受体Trk B、半乳糖凝集素-3和小窝蛋白是抑制失巢凋亡的关键介质，被认为是治疗肿瘤转移的潜在靶点［64-68］。

Trk B受体酪氨酸激酶及其配体脑源性神经营养因子(BDNF)对于神经系统的发育是必不可少的，并且是激活增殖、分化和生存的关键信号［69］。Trk B的最初发现是在儿童最常见的实体瘤——神经母细胞瘤中过度表达，并且被认为有助于转移。在体外已证实高表达Trk B可以保护神经母细胞瘤抵抗抗肿瘤药物诱导的凋亡，促进肿瘤细胞的扩散和侵袭［70-75］。

在其他许多类型的人类恶性肿瘤中也观察到了Trk B高表达，往往与转移潜能的增加相关［76］。最近遗传学研究发现Trk B可以使肿瘤细胞在循环中和远处转移部位抵抗失巢凋亡，进而具备生存优势［77，78］。因此，Trk B被认为是转移性肿瘤细胞的失巢凋亡关键抑制基因，而且几个Trk抑制剂的前期临床研究表明其可以抑制肿瘤的生长和转移［79］。因此Trk B可能是转移性肿瘤的一个潜在的治疗靶点。然而，有几个关键问题仍然有待解答，如高表达Trk B是否足以使转移性肿瘤细胞在循环中生存，TrkB的活性对保持转移表型是否是必需的。

图4-7 抗失巢凋亡与肿瘤细胞转移的机制联系

最近发现β-半乳糖苷结合蛋白成员之一——半乳糖凝集素-3(galectin-3)在恶性上皮细胞和肿瘤相关基质细胞中广泛过度表达［80］，半乳糖凝集素-3的循环水平也与许多恶性肿瘤的转移潜能有关，包括乳腺癌、胃肠道癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和霍奇金淋巴瘤［81］。值得注意的是，半乳糖凝集素-3的过度表达保护肿瘤细胞不受失巢凋亡和其他凋亡刺激(如NO)，这有助于肿瘤细胞通过循环播散［82］。

尚不清楚半乳糖凝集素-3如何提高肿瘤细胞的抗失巢凋亡能力。然而，根据半乳糖凝集素-3和外源凝集素的相似性，我们推测通过调节细胞与基质的相互作用来“恢复”肿瘤细胞和ECM之间的锚定，半乳糖凝集素-3表达的肿瘤细胞在转移过程中可能有一定的生存优势。事实上，在乳腺癌细胞系中半乳糖凝集素-3的过表达可增加细胞与层粘连蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白之间的黏附，还能增加一些整合素的表达，如已知的与肿瘤侵袭相关的α6β1。然而，半乳糖凝集素-3介导的细胞和ECM的相互作用是如何调节细胞信号的，还有待进一步阐明［83，84］。

除了增强失巢凋亡抵抗性，半乳糖凝集素-3也可以在其他几个步骤提高肿瘤细胞的转移潜能。例如，使肿瘤细胞的聚集形成微毛细管栓子，利于其生存、被内皮细胞捕获，并随后通过外渗进入继发部位［85，86］。已经证实肿瘤细胞表面的半乳糖凝集素-3通过同型聚集，可诱导转移性肿瘤细胞形成癌栓［87，88］。另一方面，半乳糖凝集素-3也可在内皮细胞表面表达，帮助肿瘤细胞停留在内皮并进一步外渗［89-91］。

有趣的是，半乳糖凝集素-3的功能似乎取决于其所处的部位。细胞质半乳糖凝集素-3强烈抑制失巢凋亡，而核半乳糖凝集素-3有促凋亡特性［92］;细胞内半乳糖凝集素-3一般作为抗凋亡因子;细胞外半乳糖凝集素-3的作用比较复杂，因为它同时作为一个抗凋亡和促凋亡因子。一些临床研究也显示在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中半乳糖凝集素-3浓度的下降，这表明半乳糖凝集素-3可能在肿瘤的不同阶段和不同细胞背景下发挥不同的作用。值得注意的是，半乳糖凝集素-3敲除小鼠并未表现出特别表型，而且它们都比较健康，这表明半乳糖凝集素-3抑制剂没有造成严重的副作用，具有宝贵的治疗价值。

Cav-1是细胞膜多孔结构穴样内陷的重要组成部分，可通过多种信号转导调控多个细胞过程［92］。由于Cav-1基因组的定位在染色体7q31.1(可能的肿瘤抑制基因区)，原来认为它是一种肿瘤抑制基因，并且在乳腺癌小鼠模型的广泛研究都支持这个观点［92，93］。尽管Cav-1在前列腺癌细胞中作为抗凋亡因子，但已证明Cav-1在不同类型的细胞中有促凋亡活性。最近的证据表明，Cav-1和前列腺癌转移有关系，Cav-1通过激活Akt途径和阻断两个丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1和PP2A，能够抑制失巢凋亡［94］。另一方面， Cav-1也参与胰岛素和IGF-1信号通路，这是一个已经被充分研究的抗失巢凋亡机制，它介导不依赖于基质的细胞存活［95］。在临床上，研究显示Cav-1在包括前列腺癌、膀胱癌、食管癌、T细胞白血病和多发性骨髓瘤等多种类型的肿瘤中高表达，而在包括乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和小细胞肺癌(SCLC)等类型的肿瘤中却低表达［92］。

Cav-1在肿瘤的发生和发展中的作用是什么? 它是一种抑癌基因还是促癌基因? 有没有可能它是负调节转移性肿瘤而促进原发肿瘤生长? 这些问题的答案可能并不简单，因为Cav-1在转移中的负效应也还存在质疑，研究发现下调Cav-1会减少E-钙黏蛋白的表达，增加Snail和β-连环蛋白的表达，结果促进EMT，增加肿瘤细胞的侵袭能力［96］。由于在不同的肿瘤中Cav-1表达的异质性，靶向Cav-1的治疗仍需要进一步阐明其在每个类型肿瘤中的具体作用。

4.2.5 细胞衰老可抑制肿瘤转移

细胞衰老限制受损细胞的增殖能力，从而成为抑制肿瘤的内在机制。据了解，循环中大部分内渗的肿瘤细胞会死亡，只有小部分能够存活并到达继发器官;有些肿瘤细胞成功定居并开始生长，还有些肿瘤细胞开始衰老成为非增殖性休眠细胞，这种细胞在临床上检测不到，并且与肿瘤复发有关。患者体内存在处于休眠状态肿瘤细胞群的临床证据不断增加，但有关诱导、维持和逃离衰老或休眠的基本机制尚不清楚。为什么有适合初期肿瘤生长的遗传和表观遗传学改变的肿瘤细胞在继发部位无法恢复增长呢? 哪些环境因素决定了播散肿瘤细胞是增殖还是衰老? 决定播散肿瘤细胞命运的信号开关是什么? 有关的这些有趣的肿瘤转移研究方向，最近的研究逐渐有了新的进展。

已知p38参与癌基因诱导衰老(OIS)。OIS的特征是在正常非转化细胞中由ras和erb-B2等活化的癌基因诱导的与端粒长度无关的衰老，被认为是一个抗肿瘤发生的防御机制。研究证明，Ras诱导的OIS是通过MEK-ERK通路介导的，通过活化MKK3和MKK6激酶，进而上调p38的活性［97］。有趣的是，最近有证据表明继发部位的微环境对肿瘤细胞有很大的影响，通过建立一个更有利于p38(而非ERK)的信号通路来诱导其衰老(图4-8)。缺氧和不合适的细胞外基质等应激信号可激活p38，随后抑制肿瘤细胞的增殖，这是通过阻断ERK信号和u PAR表达并激活p53、p27和cdc25等Go/G1细胞周期抑制剂来实现的，最终导致肿瘤休眠。应该指出的是，两个转移抑制基因MKK4/JNKK1和RKIP都被证明会抑制MEK-ERK并促进JNK和p38信号转导［98］(图4-9)。因此，这些基因可能通过诱导p38介导的衰老来抑制肿瘤转移。值得注意的是，研究发现MKK4/JNKK1在继发转移部位而不是原发肿瘤处被完全激活，这样看来，继发转移部位的环境对肿瘤细胞行为的影响显而易见，但令人费解。另一方面，p38似乎也促进细胞的存活，这提示肿瘤细胞的休眠可能是选择性适应反应的结果，即允许播散肿瘤细胞暂停生长和应对压力信号，直到可以恢复增长为止。最近发现的自分泌运动因子(AMF)机制也支持微环境对肿瘤细胞的衰老具有关键调节作用，其诱导暴露在氧化环境中的肿瘤细胞衰老和表达p21［99］。

图4-8 ERK/p38比值作为肿瘤转移中衰老或休眠的决定性因素

在循环中幸存下来的肿瘤细胞不是“困”在毛细血管，就是更加积极地黏附于血管内皮，直到它们“出来”(外渗)到远处转移部位。这种黏附和外渗的过程似乎模仿炎症部位白细胞的浸润。最近的证据表明，肿瘤细胞与内皮细胞相互作用诱导肿瘤细胞的衰老，被认为是肿瘤转移的防御机制之一。

Kai-1是公认的一个强烈抑制肿瘤转移的基因，在各类转移性肿瘤中该基因的表达显著下调。当肿瘤细胞依附内皮细胞时，肿瘤细胞表面的Kai-1分子可以与内皮细胞上的DARC结合(图4-10)。这种Kai-1与DARC的衔接触发信号可诱导肿瘤细胞衰老，最终阻止肿瘤转移。然而，已经失去Kai-1的肿瘤细胞可以避开这种自然防御系统，并成功地在远处器官渗出和形成克隆。因此，有可能针对Kai-1/DARC途径来进行抗肿瘤转移治疗。

4.2.6 基质细胞和微环境对肿瘤转移的影响

现在认为，转移潜能不仅是肿瘤细胞的固有特征，也是微环境对细胞的本质修饰。增强转移性肿瘤细胞生存能力的ECM赋予其抵抗细胞凋亡的优势，或者对特定转移性肿瘤克隆在凋亡抵抗性上提供正选择。“选定”的转移性肿瘤细胞通常被赋予特定器官的转移性倾向。换句话说，远处器官微环境(土壤)和肿瘤细胞(种子)之间的相互关系将决定肿瘤细胞是否能成功地转移到特定器官。另一方面，转移性肿瘤细胞在原发组织和转移继发部位都有抵抗ECM依赖的细胞凋亡能力，这两个部位最初可能含有不利因素和防御机制。

图4-9 应激信号通路及p38介导的衰老

图4-10 Kai-1介导的转移抑制模型

研究认为肿瘤细胞可通过对“土壤”施加特定压力诱导其提供一个宽松的环境或产生作为将来转移的前提条件。有人曾提出，肿瘤细胞的生长并通过基膜侵袭间质区，会导致间质反应生成新的间质微环境。反过来，这种变化为入侵的肿瘤细胞提供了一个极为有利的环境。改变的间质细胞称为反应间质，它能通过ECM重构，提升蛋白酶的活性、生长因子的生物利用度、血管生成和炎性细胞的涌入，促进肿瘤细胞的生存和侵袭。

在微环境里驱动转移性肿瘤细胞选择的其他各种因素中，缺氧作为促进转移级联步骤的一个关键因素已经被深入研究。通过NF-κB的活性抑制E-钙黏蛋白，同时增加N-钙黏蛋白表达，使细胞免于失巢凋亡，缺氧使EMT和破坏组织完整性变得容易。此外，缺氧上调尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)基因，从而增强侵袭前水解酶的活性，由此改变整合素和ECM组分之间的相互作用，使肿瘤细胞通过基膜侵袭。另一方面，增强的uPA/uPAR信号及其与其他途径的对话，包括整合素、生长因子受体和FAK信号，提供增殖信号并强力抑制依赖于p38的细胞衰老。

缺氧诱导HGF-cMet信号，导致肿瘤细胞向血管或淋巴管迁移。此外，HGF在肿瘤发展过程中有多重作用，担当促生存、促凋亡以及抗衰老的因子。最重要的是，缺氧诱导VEGF，它在肿瘤与基质间动态的相互作用中起关键作用，其中包括外渗、血管生成和淋巴管生成等，这些在肿瘤转移的后续阶段是必需的［100］。

成纤维细胞和成肌纤维细胞在多种人癌症基质细胞中占多数［101，102］，特别是可产生α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的大量成肌纤维细胞，已在大部分转移性人乳腺癌的基质中多次被观察到，并常常被称为“激活的成纤维细胞”或“癌相关成纤维细胞”(CAF)［103，104］。

人类癌细胞中提取的CAF可以促进免疫缺陷小鼠混合上皮癌细胞或非致瘤上皮细胞生长，这个惊人的发现在功能上明确区分了CAF和正常成纤维细胞，并引出许多有趣的问题，如CAF如何促进肿瘤的发生和发展呢? CAF前体是什么细胞? 在肿瘤进展过程中CAF是由正常成纤维细胞的演变来的，还是肿瘤细胞通过EMT演化来的? 是肿瘤细胞驱动正常成纤维细胞成为CAF的吗?

近来广泛的研究已逐渐揭示CAF耐人寻味的一面，并在肿瘤微环境方面取得了新的进展。首先，CAF似乎不太可能通过EMT从肿瘤细胞获得，因为CAF本身没有致瘤性，也没有检测到类癌特性，如核型改变和非锚定性生长等［105］。另一方面，除了成纤维细胞和成肌纤维细胞外，发现了CAF还与骨髓源性祖细胞、平滑肌细胞和前成脂肪细胞等不同类型的细胞存在异质性，表明不同起源的细胞是生成CAF复合物的原因［106］。其中，“成纤维细胞-成肌纤维细胞转化”似乎确定是CAF的一个来源，Weinberg研究组的观察证实了这一点。他们观察到正常成纤维细胞可以被招募到瘤块处，然后被迫“改造”为成肌纤维细胞，支持肿瘤的生长和血管新生［107］。

有趣的是，一些表达成纤维细胞特异性蛋白(FSP)-1的独特亚群与α-SMA阳性的成肌纤维细胞截然不同，而且可以促进肿瘤转移［108］。一些证据显示，CAF通过激活MAPK、Akt和Cox-2来提高肿瘤细胞的生存能力，促进肿瘤转移［109，110］。值得注意的是，CAF最初获得成肌纤维细胞的表型似乎依赖于肿瘤细胞的影响，一旦获得之后，即使没有肿瘤细胞的进一步信号，CAF仍然可以显示这种特质。上述特质保证CAF成功地从正常的基质转化成反应基质后的稳定性［107］。由于原发肿瘤的遗传不稳定性，肿瘤微环境不得不面对不同表型肿瘤细胞亚群的连续挑战。然而，一旦微环境发生了由先前的肿瘤细胞诱导的相应转换，可以保持这一有利条件来对付后来的肿瘤亚克隆。这是类似“转移前壁龛”(premetastatic niche)的理论范例，宿主器官微环境可能受到某些循环肿瘤细胞的调节，进而促进肿瘤细胞的转移。

转移前壁龛是否存在仍有争议。然而在组织中致癌迹象明显出现前，已观察到转移前壁龛发生了早期改变，包括早期持续的炎症反应、基质重塑、ROS的增加和其他的生物活性致癌分子，如VEGFR1、MMPs等。这表明局部组织环境的变化是转移的重要组成部分［111-113］。

此外，转移前壁龛理论可以部分解释为什么转移有器官特异性这个长期困扰的问题。似乎肿瘤细胞归巢到特定的器官是因为特定器官中有利的自然条件或通过预处理获得的生长条件。例如，在乳腺癌溶骨性骨转移时，骨中的骨母细胞本身自然产生细胞因子，它是转移性乳腺癌细胞的趋化因子。同时，转移性乳腺癌细胞控制骨母细胞产生炎性细胞因子，如与激活破骨细胞以及乳腺癌细胞迁移和存活相关IL-6和IL-8［114-116］。

最近肿瘤相关基质的研究强调了靶向肿瘤相关基质的好处，虽然还需要更多的临床观察来证明间质成纤维细胞和成肌纤维细胞的数量与人类癌患者的预后不良显著相关。考虑基质细胞对肿瘤生长和转移的关键作用，以及化疗过程中基质细胞较适应性突变的肿瘤细胞遗传上更稳定，对基质细胞更多的研究可能有助于发展选择性抗转移治疗，也有助于鉴定生存和信号通路之间的多个关键点，这可能代表了一个抗癌药物的有用靶标。

4.2.7 存在的问题和临床前景

转移研究领域的最新进展已经开始揭示细胞凋亡和衰老在肿瘤进展过程中扮演的关键角色，并发现了转移过程中特异性细胞死亡和生存的新信号通路，它们通过对话网络以达到平衡。然而，许多问题仍有待回答。

对于肿瘤细胞，通过遗传和表观遗传突变获得对细胞凋亡和衰老的抵抗是变成转移性肿瘤细胞的必要步骤，重要的是它们何时以及如何获得这些突变。这些突变发生在原发瘤部位，还是在转移过程中被“选中”? 在这些肿瘤细胞的什么信号发生了改变? 在这方面，我们需要清楚地了解肿瘤转移干细胞这个新概念。在多种肿瘤中，肿瘤干细胞在肿瘤发展起始阶段的重要性得到了认可，但是肿瘤干细胞在转移方面的作用仍然处于假说阶段。如果“转移干细胞”存在，它们是否有独特的抵抗凋亡的机制? 它们何时何地获得这种能力? 回答这些问题可能会显著影响未来转移性疾病的治疗方案。

通常被认为肿瘤转移是含有“主动”和“被动”两方面因素的细胞过程，首先能够被其内在的遗传改造来帮助其增殖，不依赖锚定生存，然后侵袭并引导向其偏好的宿主器官，通过外渗及在下一部位形成克隆。另一方面，转移效率是由外在信号和环境的压力被动控制的，包括进入血管、血液流动压力和毛细血管的被动滞留等。

多年对转移的研究侧重于阐明肿瘤细胞的遗传改变，但已越来越清楚地看到肿瘤微环境在肿瘤的发生和发展起着举足轻重的作用。我们还了解到，无论是原发部位还是远处器官的肿瘤微环境，对决定转移细胞凋亡和生存起至关重要的作用。肿瘤细胞似乎可以修改基质，而基质本身就可以产生肿瘤生存、生长和进展的正相或负相调控信号。这些癌基质细胞——反应基质，有清晰的遗传图谱并表达各种因子来维持肿瘤细胞的生存。因此，至关重要的是了解“正常”基质细胞何时以及如何成为活跃的基质。

尤其令人感兴趣的是“侵袭前沿”的基质细胞，它由独特的肿瘤细胞亚群组成，并与器官特异性支持细胞接触，即活化成纤维细胞(CAF)，它是类似转移前部位的一个范式，在这个部位的肿瘤细胞正在进入一个新的微环境。从激活抗凋亡信号通路方面了解反应基质和转移性细胞互惠的相互作用也是同样重要的。目前正在积极地进行这些方面的研究。

如前所述，认为肿瘤细胞归巢到特异转移部位是因为该靶器官具有有利生长条件。然而，肿瘤细胞表达的特定X-转移性基因标签(X指特定器官)也在各种肿瘤中被发现，它与转移性肿瘤细胞的归巢倾向有关。例如，MDA-MB-231乳腺癌细胞系骨源性转移亚群的基因组分析发现骨桥蛋白、CTGF、FGF5、IL-11、CXCR4、MMP1和ADAMTS1的表达。此外，最近在肺癌中也发现了骨转移基因标签，包括TCF4、PRKD3、SUSD5和MCAM［115］。

肿瘤细胞这些X-转移性基因标记的表达和特定器官独特的生长条件之间有什么必然的联系吗? 换句话说，这些基因是由独特部位诱导表达的，还是微环境选择了表达特定基因标记的转移性肿瘤细胞? 对转移性基因标签在功能以及时间和空间表达上进行更多的研究，可能最终揭示转移性肿瘤细胞的器官特异性归巢的分子机制。

最重要的问题是，如何将在这一领域研究获得的信息转化到临床应用中。了解肿瘤细胞死亡和生存的途径并确定其中的关键因子，可能帮助设计分子“标签”谱，以准确地预测患者的转移状况和生存方面的结果。阐明可能决定肿瘤细胞器官特异性转移的内在生存能力，以及确定在转移级联过程中涉及凋亡抵抗性的机制和关键因子，也有助于寻找转移性疾病的治疗靶点(表4-2)。

表4-2 转移相关的细胞凋亡因子

续表

续表

注: 转移级联:1.为转移的初始步骤，包括分泌薄壁细胞脱离ECM和肌动蛋白骨架的破坏;2.为内渗、循环和外渗;3.为在继发部位生存和定植。

确定转移干细胞的作用和抗凋亡的机制，可能会完全改变转移性疾病的治疗过程。肿瘤治疗的最难之处是防止多年后肿瘤的复发。然而，如果能够理解肿瘤细胞衰老和休眠的确切机制，在未来我们可能开发一种维持肿瘤细胞“冬眠”的药物。

(郑燕翻译，钦伦秀审校)

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