肿瘤侵袭和转移中的蛋白水解级联反应

◎Steven D.Mason，Johanna A.Joyce

在肿瘤进展过程中有多个关键阶段需要蛋白水解酶的作用(图5-5)。首先诱导血管生成或新血管生长过程中包括血管基膜的降解，释放和(或)激活基质中促血管形成的生长因子。第二，侵犯到周围组织的肿瘤细胞需要解除细胞间连接并使上皮基膜/细胞外基质(BM/ECM)降解，从而使肿瘤细胞从原发肿瘤位置向外扩散。第三，至少有两个转移的关键步骤需要蛋白水解的作用:肿瘤细胞从原发瘤侵袭进入血液或淋巴循环以及而后渗入到继发组织器官中。以上两个过程中蛋白酶具有促进肿瘤细胞的定植和生长作用。

蛋白酶不但在BM/ECM蛋白降解中发挥关键作用，在例如生长因子和细胞因子前体域的限制性剪切和随后的激活等过程中，尤其是细胞信号传导过程中也扮演着重要角色。这些功能在一系列蛋白水解相互作用的级联反应中受到严格调节，从而使转移中蛋白水解反应的控制或放大成为可能。

由于对蛋白水解在转移多步骤中关键作用的认识，使我们意识到识别促进肿瘤的关键蛋白酶的重要性。为此需要确定这些蛋白酶间的相互作用，并制订相应的治疗策略，以抑制其作用。在这一章中，我们将讨论蛋白酶如何在复杂而又相互关联的级联反应中发挥作用，从而为微环境中肿瘤细胞和间质细胞所共同利用以促进肿瘤的侵袭和转移。

5.2.1 背景和历史

人类基因组包含至少570个蛋白酶和156个内源性蛋白酶抑制剂，组成了哺乳动物最大的功能蛋白群之一。根据其不同的催化机制(例如，半胱氨酸蛋白酶需要在活性位置有半胱氨酸残基)，将蛋白酶可分为5类:天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶。蛋白酶有成千上万的作用靶标，因此调节几乎所有细胞活动，为肿瘤细胞提供多种利用蛋白酶活动促进肿瘤的增殖、侵袭和转移。到目前为止，有关蛋白酶及其对癌症作用的研究大部分集中在ECM的重塑和促进肿瘤侵袭两个方面，一些临床试验尝试研究抑制基质重塑的蛋白酶和蛋白酶家族作为癌症治疗的可能方法。

图5-5 在转移级联反应中蛋白酶的作用

注: 蛋白水解活动在转移级联反应中的各个步骤都非常重要，包括血管生成和原发瘤向周围基质的侵袭、血管侵袭、肿瘤细胞外渗和进出循环系统，以及原发瘤在新的宿主组织的血管生成和侵袭。蛋白酶可由肿瘤细胞和间质细胞提供，如图5-7所示。

在蛋白酶抑制的临床试验中，最著名的例子是已经Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验的基质金属蛋白酶(MMP)广谱抑制剂。遗憾的是，看似充满希望的临床前期数据并没有在临床应用中获得成功，其对患者的治疗效果几乎可以忽略［1-3］。而作用于蛋白酶体的抑制剂获得了更好的效果，肿瘤细胞比正常细胞对蛋白酶体的抑制更为敏感(原因尚不清楚)。迄今，研究已经证明蛋白酶抑制与传统的化疗方法相结合在多发性骨髓瘤中有较好的疗效［4］。一种称为组织蛋白酶K的半胱氨酸蛋白酶，在骨吸收中发挥重要作用，同时在骨转移微环境基质细胞和肿瘤细胞作用下上调。针对组织蛋白酶K的小型分子抑制剂目前正在通过Ⅱ期临床试验测试其治疗骨转移的能力［5］。

从另一个角度，多种证据表明多种蛋白酶还可作为肿瘤发生的抑制因子［6］。值得注意的是caspase，它参与细胞凋亡复杂级联反应的触发，并经常在肿瘤中发生突变［7-10］。其余的蛋白酶被发现在某些条件下可抑制肿瘤，但在其他时候则促进肿瘤发展。本章将讨论这一类蛋白酶的具体例子。还有MMP也属于这一类，可能是MMP抑制剂在临床上试验失败的原因。

从上述信息可以推断，大部分研究针对蛋白酶及其抗癌活性，主要集中在个别蛋白酶和它们的功能。然而，对肿瘤相关蛋白酶的研究发展迅速，从单一的蛋白酶到错综复杂的蛋白水解反应网络，其中也有一部分重叠在一起，类似经典的信号级联反应(图5-6)。将蛋白酶看作蛋白水解级联反应的组成成员，可以为它们的活动提供适当的背景，从而对他们的靶点和生物作用进行完整的评估，使一个更清晰的降解组学(degradome)呈现在我们面前。“降解组学”这个词由Lopetz-Otin和Overall［11］创造，用于描述在特定条件下由细胞、组织或器官共同表达的所有蛋白酶以及所作用的底物。凝血通路正是正常生理条件下一种必需的蛋白水解级联反应的典型例子［12］，它可有效说明级联顶部的关键触发蛋白酶如何通过效应蛋白酶在多个步骤中逐步放大反应。

在本身具有巨大潜在破坏力的蛋白水解级联反应的背景下，蛋白水解酶活性必须在多层次得到控制，以避免异常或过量的蛋白质水解，保护细胞和有机体。与许多基因一样，蛋白酶在转录水平受到细胞内和细胞外刺激的调节，如生长因子和缺氧。蛋白酶刚合成时为无活性的前体，必须经过某种形式的构象变化或水解裂解才能作用于底物。此外，内源性蛋白抑制剂可以直接影响到许多蛋白酶的蛋白水解活性。最后一层的调节，在于它们的亚细胞定位。例如，在溶酶体或在正常细胞表面的区室化限制了其激活广泛潜在底物的能力。蛋白酶的激活、其内源性抑制剂及目标作用物形成了复杂的级联蛋白水解相互作用的网络。

将蛋白酶与底物的相互作用看作级联反应的一部分，可有助于了解蛋白水解酶活性的重要概念(图5-6)。首先，可以看出存在于多条通路的关键上游蛋白酶，揭示在这些汇聚点处可以通过单一的蛋白酶抑制或激活影响多个进程。天冬氨酸蛋白酶——组织蛋白酶D就是例子，它可以激活其他几个下游蛋白酶，而这些蛋白酶又可以作用于其他蛋白酶或造成对非蛋白酶底物的切割。另外，通过级联反应可以放大信号。例如，一个上游的蛋白酶可直接激活几个肽蛋白水解酶，其中也可能激活额外的肽底物，导致蛋白水解酶活性的显著增加。同时，也存在很多反馈回路和级联反应;即蛋白酶可以由多个不同的上游蛋白酶激活。

图5-6 水解级联反应中的关键性相互作用

注: 考虑到其中的蛋白酶之间交错的联系，这个水解级联反应的例子可被准确地称为水解网络，而其中包括有多种催化机制。几个关键“结点”分别是组织蛋白酶B、弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶，由此揭示了不同的癌症可能利用的共同通路。其中的许多蛋白酶可受到内源性蛋白酶抑制剂调节，使得该级联反应又被赋予了另外的复杂性。

蛋白水解级联反应导致ECM降解的观点已出现了一段时间，控制致瘤过程所涉及的蛋白水解级联反应也有阐明。一个著名的例子是caspase级联反应导致的凋亡。在此过程中，由于不同的凋亡刺激，触发caspase和执行caspase等被激活，最终导致细胞程序性死亡。caspase和caspase级联反应所覆盖的过程非常广泛，本章只作简要概述。

5.2.2 蛋白水解级联反应:细胞内外信号通路

蛋白水解级联反应可根据相互作用的亚细胞定位分为几类。一些反应发生在细胞内，如细胞质或溶酶体等地方，或在细胞内的质膜表面。然而，许多反应发生在细胞外，如在 ECM 中，在质膜的细胞外侧，或在侵入性伪足(invadopodia)、伪足小体(podosomes)、小窝(caveolae)等特殊结构中。对组织蛋白酶B和其部分底物以及基质金属蛋白酶的研究中已观察到这种互相作用和激活的机制。我们将以在细胞内外均有活性的蛋白酶为例，讨论细胞内外的蛋白水解级联反应。

(1) 细胞内相互作用

细胞内蛋白水解级联反应的发起是通过激活细胞质或溶酶体的上游蛋白酶而实现的，并迅速扩大到不同位置、不同类型的蛋白酶。虽然有几个溶酶体蛋白酶转位到细胞质或由肿瘤细胞分泌，导致对级联反应真正开始位置的疑问，但溶酶体依然是公认的级联反应的始发位置［13］。

组织蛋白酶D:组织蛋白酶家族是肿瘤转移的著名蛋白酶家族，其在人类有14个组成成员，其中两个蛋白酶在激活区有天门冬氨酸残基(组织蛋白酶D和E)，一个丝氨酸蛋白酶(组织蛋白酶G)，以及11个半胱氨酸蛋白酶(组织蛋白酶B，C，F，H，K，L，O，S，W，V/L2，和X/Z)。从图5-6可以看出，组织蛋白酶D是水解级联反应上游的胞内蛋白酶。组织蛋白酶D一般作用于溶酶体［14］，已发现其与肿瘤进展和转移相关［15，16］，并且肿瘤细胞可分泌其前体［17］。组织蛋白酶D的调节发生在许多水平上，如可在转录水平上受缺氧环境［18］和丝氨酸蛋白凝血酶诱导的通路而上调［19］;组织蛋白酶D的蛋白水解酶活性受p H值(其在体外p H值6.2条件下被激活［20］)和合成前体剪切的调节。有趣的是，大多数其他蛋白酶不同，尚没有已知的组织蛋白酶D内源性蛋白抑制剂。

组织蛋白酶D最初合成为一个分子量52000的前体，与甘露糖-6-磷酸(M6P)受体结合，从而定位于溶酶体并裂解为一个分子量48000有催化活性的中间体［21，22］。但其还需进一步裂解成为由两个独立肽组成的成熟酶——一个分子量14000和一个分子量34000的单链［14］。两个半胱氨酸蛋白酶——组织蛋白酶B和L，参与了组织蛋白酶D由分子量48000转化为34000形式的处理过程［14］。组织蛋白酶D也可以在酸性(p H＜5)环境中自激活，其产物是伪组织蛋白酶D，但其生理意义尚存疑问［23］。

组织蛋白酶D的作用靶标包括蛋白酶、蛋白酶抑制剂、ECM蛋白和趋化因子。组织蛋白酶D可通过两种不同的方式影响半胱氨酸蛋白酶的活性。首先，它会激活组织蛋白酶B和L前体，与其两个激活蛋白酶共同组成激活反馈回路［24］。此外，它可裂解灭活内源性胱抑素(cystatin)，进一步增强半胱氨酸蛋白酶活性［25］。

如前所述，临床证据显示组织蛋白酶D与肿瘤进展和转移相关。组织蛋白酶D及其前体在乳腺癌组织中比正常乳腺组织上调达50倍［26］。此外，与组织蛋白酶D在肿瘤的失调有关，组织蛋白酶D胞质水平可作为远处转移和生存预后指标［27，28］。最后，对多个大规模患者样本的数据库分析发现，组织蛋白酶D水平可以作为侵袭性乳腺癌的标记［29］。组织蛋白酶D在体内肿瘤进展和转移中的重要性也被证明，高转移性乳腺癌细胞株表现出组织蛋白酶D表达的增加［30，31］，组织蛋白酶D敲除策略可抑制乳腺癌移植瘤的生长及降低其转移到肺的可能性［19，32］。但是，这些影响的确切机制仍然没有得到解决。

组织蛋白酶B:组织蛋白酶B是组织蛋白酶D的直接作用靶标之一，通常可在溶酶体内被发现，是一种半胱氨酸蛋白酶。在转录水平上，组织蛋白酶B的表达可被SPL、SP3、Etsl转录因子所调控［33］。其中，Etsl与肿瘤特别相关，在不同类型的肿瘤Etsl的表达往往与预后差相关。Etsl也可以上调其他蛋白酶［34］。组织蛋白酶B调节的其他非蛋白机制包括m RNA的稳定［35］、选择性启动子［36］以及选择性剪接［37］。

除了组织蛋白酶D，其他可激活组织蛋白酶B的蛋白酶包括组织蛋白酶G、弹性蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂(t PA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(u PA)，以上都提供了针对蛋白水解级联反应的组织蛋白酶B的切入点［24］ (图5-6)。其中，最有力的组织蛋白酶B抑制剂是胱抑素C［38］，可被弹性蛋白酶灭活，为弹性蛋白酶提供了另一种提高组织蛋白酶B活性的途径。此外，组织蛋白酶B水解的目标广泛而多样，包括其他蛋白酶前体、蛋白水解酶抑制剂和ECM组成成分等。由于调节组织蛋白酶B及广泛的下游蛋白水解目标的蛋白酶的多样性，使其在蛋白水解级联反应中成为一个中心节点(图5-6)。但是，得出以上结论必须考虑它也是研究最多的蛋白酶之一，很可能其他蛋白酶具有与其相同和广泛的调控因子和作用物，但它们的活性范围尚未被完全发现。

已在ECM的降解和血管生成的过程中发现组织蛋白酶B的一些重要作用，但组织蛋白酶B是直接或间接通过其他蛋白酶发挥以上作用尚未定论，很可能两者均有贡献，或还依靠所在的组织环境。组织蛋白酶B的胞外活动将在后面讨论，但其蛋白水解相互作用可能发生在细胞内或细胞外，包括其激活MMPs和u PA，以及灭活组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)的能力。利用只在细胞内环境发挥作用的细胞渗透性抑制剂观察到肿瘤侵袭中组织蛋白酶B的细胞内活性，在该情况下黑色素瘤和前列腺癌细胞的侵袭性减弱［39］，提示胞内组织蛋白酶B在IV型胶原的降解及内吞过程中发挥重要作用［40］。包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等多种不同类型肿瘤细胞内已发现胶原蛋白片段。此外，在不同的肿瘤微环境中的基质成纤维细胞和巨噬细胞也被证明可内吞并降解胶原蛋白，提示间质细胞对水解降解ECM具有突出贡献［41］。细胞内组织蛋白酶B可降解ECM的组成部分，该结果提示有可能设计将细胞内及细胞外蛋白酶作为靶点的治疗方法。

与组织蛋白酶D类似，一些临床相关性研究也提示组织蛋白酶B在不同类型肿瘤中具有不同的表达模式，在肿瘤进展中发挥作用。已报道在乳腺癌和结肠癌的肿瘤细胞、巨噬细胞和成纤维细胞中可检测到组织蛋白酶B的表达，即在肿瘤组织的癌细胞和基质细胞中均有组织蛋白酶B的表达，并涉及肿瘤进展和转移过程中不同基质成分［42，43］。而在其他肿瘤中组织蛋白酶B仅仅表达于巨噬细胞［43］或癌细胞［44］。多个高转移潜能的细胞系和肿瘤也存在组织蛋白酶B的表达水平升高，使组织蛋白酶B成为抗癌治疗中的重要靶蛋白酶。

胱抑素C及E/M是两个强效的内源性组织蛋白酶B抑制剂，后者在肿瘤进展中常表现为下调趋势［38］。令人惊讶的是，胱抑素C敲除小鼠注射黑色素瘤细胞形成的肺转移瘤显著比野生型小鼠的肿瘤小［45］。在其他小鼠模型中，胱抑素C的过度表达可抑制肺转移［46，47］。提示其在癌症发展中的作用，可能不只是通过对组织蛋白酶B的影响，可能还依赖于其他微环境因素。

组织蛋白酶L:组织蛋白酶D的另一个直接激活目标是与组织蛋白酶B有许多相似之处的组织蛋白酶L。组织蛋白酶L基因座有不同的启动子和剪接位点［48，49］，可能由于其转录子较短，在恶性肿瘤细胞中常明显上调。组织蛋白酶L和组织蛋白酶B的区别之一是组织蛋白酶L在没有被充分激活的状态下仍有剪切纤连蛋白和层粘连蛋白的能力［50］。完全激活的组织蛋白酶L也可切割I型和IV型胶原［50］。

组织蛋白酶L的一个重要底物是基质降解酶乙酰肝素酶，是人类基因组唯一表现有剪切肝素硫酸蛋白多糖酶能力的蛋白酶。乙酰肝素酶已被证明可在黑色素瘤和胰腺癌中促进肿瘤进展和转移，这种作用可能是通过释放ECM的生长因子而实现的。组织蛋白酶L激活肝素酶的能力已在体外被证明，而体内实验证明小鼠组织蛋白酶L缺失时肝素酶前体含量增加［51］。

在胰岛细胞癌RIP-Tag小鼠模型中，组织蛋白酶L在肿瘤细胞中的表达高于基质细胞［52］，同时也可由激活的巨噬细胞所分泌［53］。组织蛋白酶L缺失的RIP-Tag小鼠肿瘤生长、增殖和侵袭受到显著抑制，同时细胞凋亡增加［54］。这表明无论组织蛋白酶L是什么来源，将其作为靶点可能是癌症的一个有效治疗策略。此外，针对转移模型中的组织蛋白酶L，使用稳定表达的抗组织蛋白酶L的单链变体［55］或小分子抑制剂［56］，可相对减少黑色素瘤转移到肺或骨骼。临床研究发现组织蛋白酶L在乳腺癌、前列腺癌和结肠癌中的活性增加，也说明组织蛋白酶L和肿瘤进展之间存在联系［57-61］。

然而，一些证据表明，组织蛋白酶L可能有肿瘤抑制功能，这取决于组织环境。小鼠组织蛋白酶L的缺失导致皮肤增殖加强［62］，并且在Apc Min大肠腺瘤模型中可增加肿瘤的发病率［63］。此外，小鼠过度表达一个强有力的组织蛋白酶L抑制剂——人类hurpin(丝氨酸蛋白酶抑制剂B13)，导致对化学诱发癌变的易感性增加［64］。组织蛋白酶L的其他内源性抑制剂包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，D，E /M，SA和SN。不过，在肿瘤中这些抑制剂的研究仍然是不完整的。进一步证据支持组织蛋白酶L通过其在体外剪切凋亡蛋白前体Bid的能力，有可能引发细胞凋亡，从而作为一个潜在的肿瘤抑制因子。因此，组织蛋白酶L，至少在已有研究的动物模型中，在特定的组织方式下，可能在肿瘤的发生发展中扮演完全相反的角色。因此，在确定肿瘤中组织蛋白酶L的实际活性范围前，考虑微环境背景是十分必要的。

蛋白酶调节的一个重要因素是p H值，在肿瘤中尤为重要。由于组织蛋白酶主要是溶酶体酶，一般在酸性p H值(p H＜6)时功能最活跃。肿瘤组织蛋白酶H和组织蛋白酶S例外，它们分别在p H=6.8［65］和6.5［66］时功能最为活跃。至于蛋白酶在肿瘤发生和转移过程中是在细胞内还是细胞外发挥其功能的问题，p H值的依赖性似乎更倾向于细胞内。然而，组织蛋白酶B和L在p H=7时功能最稳定，组织蛋白酶C在p H=7.5时功能最稳定，而组织蛋白酶H、K和S在p H=8时功能最稳定［65］。此外，很多报道称，肿瘤微环境是酸性的。同时体内p H值测量结果表明，随着肿瘤的大小细胞外p H值在6.2～6.9之间变化［67，68］。这使得肿瘤微环境的酸度维持在一个水平，以保证组织蛋白酶功能的稳定和潜在活跃状态，结合许多蛋白酶在肿瘤和转移中上调，以上实验证据都支持在肿瘤微环境酸度下蛋白酶可发挥细胞外作用。这一说法的根据来自一项研究，在微酸性条件(p H=6.8)下培养黑色素瘤细胞可促进实验中的肺转移。这种作用可能会被基质金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶抑制剂所阻断，说明上述两个蛋白酶家庭成员也参与了这个过程［69］。

弹性蛋白酶:弹性蛋白酶(elastases)是一种丝氨酸蛋白酶，和组织蛋白酶一样，可以在肿瘤转移相关蛋白水解级联反应的几个不同步骤中发挥作用(图5-6)。弹性蛋白酶可分为3大类:猪胰弹性蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和金属弹性蛋白酶。NE与肿瘤的关系是迄今为止研究最多的，也是唯一已被证明可降解的不溶性弹性蛋白［70］，因此与ECM重构及肿瘤转移有着很大关系。

NE通过核结合因子、增强子结合的淋巴因子1、GFI-1和C/EBP发挥转录调控作用［71，72］。弹性蛋白酶合成时是无作用的蛋白前体，可以被组织蛋白酶C［73］或纤维蛋白溶酶激活，是中性粒细胞颗粒(与组织蛋白酶G、胶原酶，明胶酶和某些MMPs一起)的重要组成部分，可以激活许多其他蛋白质［74］，包括组织蛋白酶B、u PA［75］和几个基质金属蛋白酶［50］。由于NE的许多目标是细胞外蛋白质或ECM成分，弹性蛋白酶的作用物(和抑制剂)将在分泌蛋白酶部分作进一步讨论。

许多证据显示NE参与肿瘤的发展过程。NE的抑制剂(某些更具有特异性)可阻止或减少肺转移的发生［76，77］，并抑制肿瘤细胞在体外黏附内皮细胞的能力［78］。弹性蛋白酶活性在乳腺癌患者中可检测到［79］，并且NE水平的升高与肿瘤患者无病生存期显著减少相关［80］。同样，NE表达增加的非小细胞肺癌患者总生存率下降［81］。有趣的是，在肿瘤中NE的表达不一定限于浸润的中性粒细胞，乳腺癌和肺癌细胞株也被发现可表达NE［82，83］。

弗林蛋白酶和其他前蛋白转换酶:弗林蛋白酶(furin)是一种丝氨酸蛋白酶，属于前蛋白转化酶家族(PC)。后者是指一组钙依赖性的内切蛋白酶，也被称为激素原转化酶家族。目前为止，除了弗林蛋白酶以外，还有8个已知的人类PC;其中4个(包括弗林蛋白酶)包含一个跨膜结构域，使得其活动范围限于高尔基复合体网络(TGN)和细胞表面［84］。PC1和PC2在分泌颗粒中被发现，可处理分泌调节途径中裂解的蛋白质［84］。与其他蛋白酶一样，PC合成后在接受自我剪切和激活前是没有活性的酶原［85］。其中弗林蛋白酶可在进入高尔基复合体网络之前在内质网中发生自剪切［86，87］。有趣的是，由PC分解的前体肽也具有PC内源性抑制剂功能。前体肽的多分裂导致其与蛋白酶完全解离及弗林蛋白酶被激活［88］。PC的自激活能力使得其独立于组织蛋白酶D、半胱氨酸蛋白酶和弹性蛋白酶之外，成为蛋白水解级联反应新的切入点(图5-6)。

虽然弗林蛋白酶和PC有许多蛋白水解底物，包括MMP-11和MT1-MMP(也称为MMP-14)，它们由弗林蛋白酶和TGN中的PACE激活［50］。PC其他与肿瘤转移特别相关的作用靶标包括类胰岛素生长因子及其受体、整合素和VEGF-C［88］。沿着这一思路，一些研究已揭示PC的表达与肿瘤进展有很大相关性。其中包括PC1在嗜铬细胞瘤［89］、肺类癌和小细胞肺癌［90］中的过度表达;在乳腺癌［91］、结肠癌和头颈部肿瘤［92］中也发现弗林蛋白酶的异常表达; 在肝癌细胞株中弗林蛋白酶的上调表达可导致肺转移的增加［93］，而在结肠癌细胞中PC抑制剂α1-PDX(丝氨酸蛋白酶抑制剂的变体)的过度表达可使肝转移率下降［94］。因此，一些研究小组正在试图通过使用PC前体肽、氯酮和丝氨酸蛋白酶A1抑制剂抑制弗林蛋白酶和PC的作用［84］。

基质金属蛋白酶:基质金属蛋白酶(MMP)可以在细胞内或细胞膜上被激活。关于基质金属蛋白酶在其他章节有更详细的讨论，因此这里对于MMPs在蛋白水解级联反应中的作用及后面在细胞外相互作用的部分都只作简短介绍。如前所述，激活MMPs的蛋白酶包括组织蛋白酶B、弹性蛋白酶和弗林蛋白酶。9个基质金属蛋白酶由弗林蛋白酶激活，导致巯基静电的相互作用消除。至于其他18个已知的蛋白酶缺乏弗林蛋白酶识别域，其激活机制还没有完全明确［95］，但潜在的激活机制包括氧化或烷化剂、变构激活和由其他蛋白酶激活(包括纤维蛋白溶酶、组织蛋白酶B、弹性蛋白酶和其他蛋白酶)。其他非蛋白水解的蛋白也可能参与其中。例如，通过MT1-MMP和TIMP2的相互作用可激活MMP-2已被证实，它揭示了通常被认为是MMPs抑制剂——TIMP2新的相反作用［96，97］。然而，这些激活机制只在体外被证实，在体内目前尚缺乏确认其生理作用相关的证据。

caspases与细胞凋亡:最佳的蛋白水解途径之一是内在由caspase介导的蛋白水解相互作用级联反应组成的凋亡途径。虽然转移中的细胞凋亡在其他章节有更彻底的讨论，在这里我们简要介绍caspase级联与本章所讨论的一些蛋白酶之间的联系。caspase级联反应不同于广泛的促进肿瘤的蛋白酶，它提供了具有肿瘤抑制作用蛋白酶的重要例子。

如前所述，几种不同的蛋白酶可以各种方式参与凋亡级联反应。组织蛋白酶D可以通过独立于蛋白水解途径之外的通路发挥抗细胞凋亡的作用。组织蛋白酶B、H、K、L和S，钙蛋白酶，颗粒酶B在其体外诱导切割Bid的饵袢，可能导致释放［98-102］细胞色素C和激活内在凋亡通路。此外， caspase-2活化紧跟在组织蛋白酶B细胞质释放之后，导致内在凋亡途径的激活［103］，为另一个促进细胞凋亡的上游蛋白酶的机制提供证据。

caspase级联反应的逃避在转移中有重要作用。在神经母细胞瘤中有报道，抑制肿瘤细胞的caspase-8可阻止细胞凋亡并促进肿瘤转移［104］。导致细胞凋亡的众多途径不断被阐明，除了直接水解相互作用越来越多，可能有更多的被蛋白酶激活的信号分子被发现可导致细胞凋亡。凋亡逃逸因其在肿瘤发展中的核心地位，一直是重要的研究领域。

(2) 细胞外相互作用

浆膜部位的相互作用:胞外蛋白水解作用可分为两大类，即发生在细胞膜的相互作用(已经分泌蛋白酶和其他蛋白酶)或ECM成分之间发生的相互作用(图5-7)。由于在不同的细胞微环境下有不同的底物，转位和分泌对酶与底物间的相互作用具有很大的影响。已证明细胞表面的伪足小体(podosomes)、侵入性伪足(invadopodia)和小窝(caveolae)等结构把蛋白酶集中在一起，从而促进蛋白酶的相互作用。伪足小体和侵入性伪足是由多种细胞类型产生并有丰富肌动蛋白的黏附结构，可以促进ECM降解。伪足小体往往是均匀地分布在一个区域，而侵入性伪足往往较大，并以小群形式聚集。巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞均被发现可形成伪足小体，而肿瘤细胞通常形成侵入性伪足。它们的蛋白酶成分非常相似，如在伪足小体和侵入性伪足中都发现有基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9、MMP-14)、丝氨酸蛋白酶(seprase，二肽基肽酶IV)和u PA受体(u PAR)［105］。

小窝是细胞的脂质膜内陷，含有多种蛋白酶和相关蛋白。组织蛋白酶B就是上述蛋白酶之一，它通常是一种溶酶体蛋白酶，但往往在许多不同类型的肿瘤中易位到细胞表面。虽然组织蛋白酶B易位的确切机制仍在研究中，但已知组织蛋白酶B与u PA及其受体，在结肠癌中通过膜联蛋白II异四倍体(ALLT)［106］定位在小窝，直接绑定到ALLT S100A10轻链［107］，揭示了组织蛋白酶B保留在细胞表面的潜在机制，可促进MMPs和u PA的激活。迄今，MMP-2和MMP-3已被证明是由组织蛋白酶B激活［108，109］，同时组织蛋白酶B定位于细胞表面增加了这些相互作用的可能性。此外，组织蛋白酶B剪切和灭活两个强有力的MMP抑制因子为TIMP1和TIMP2。因为在细胞表面组织蛋白酶B和u PA前体/u PA受体复合物更为靠近，所以组织蛋白酶B可使u PA前体向u PA活化［110］也更有可能发生在这里。

除了蛋白酶底物，组织蛋白酶B也剪切部分细胞表面及ECM的组成成分，包括E-钙黏蛋白［54］、纤连蛋白［111］、胶原蛋白、层粘连蛋白和弹性蛋白［50，112］。降解ECM的底物可以释放生长因子，从而促进增殖和血管生成，这是肿瘤发展和转移中的重要步骤。支持组织蛋白酶B在这个过程中作用的证据来自利用组织蛋白酶B缺失的乳腺癌和胰腺癌转基因小鼠模型的基因敲除研究。在RIP-Tag胰岛模型中，组织蛋白酶B缺失时肿瘤的生长、增殖、侵袭以及血管生成受损，而细胞凋亡增加［54］。在MMTV-Py MT乳腺癌模型中，组织蛋白酶B的缺失降低了肿瘤的生长和转移［113］，也揭示了两个微环境之间耐人寻味的相互作用。首先，癌细胞上调蛋白酶X/Z(另一种半胱氨酸蛋白酶)以补偿组织蛋白酶B的缺失，说明蛋白水解作用可互相弥补，显示选择性靶向蛋白酶研究的困难。其次，基质而不是癌细胞中的组织蛋白酶B缺失，仍然可抑制肺转移瘤的形成和生长，提示基质来源蛋白水解活性在肿瘤进展中的重要作用。

进一步的研究证实，基质细胞，特别是浸润的免疫细胞和血管内皮细胞，与已证实的半胱氨酸蛋白酶［52］、NE和几个基质金属蛋白酶一起，可促进蛋白酶的表达。局限于质膜上的蛋白酶和分泌的蛋白酶可以使不同类型的细胞产生蛋白水解级联反应中的不同成分，这将有利于激活和放大级联信号和蛋白裂解(图5-7)。这方面的例子包括肿瘤细胞和成纤维细胞的蛋白酶互惠上调［114］。由于癌细胞与成纤维细胞或巨噬细胞的联合培养，使得细胞周围和细胞内的基质金属蛋白酶、纤维蛋白溶酶和半胱氨酸蛋白酶的活性增强，从而使降解IV型胶原的能力增强［41］。类似上述的共同培养实验，或一些肿瘤及间质的作用可以很容易被识别和调节的体内基因实验，大大增加了我们对癌细胞与基质细胞的蛋白水解级联相互作用的理解，这将是非常重要的。

图5-7 蛋白水解级联反应中的肿瘤微环境

注: 除了肿瘤细胞，还有各种间质，包括纤连蛋白、内皮细胞和免疫细胞，都可以促进肿瘤转移微环境中的蛋白水解级联反应。这些成分参与其他蛋白酶的激活(A)、细胞粘连蛋白的切割(B)、ECM的降解(C)、入侵循环系统(D)(图来源: Joyce，2005［159］以及Gocheva和Joyce，2007［160］)。

uPA/uPAR和tPA/tPAR:接下来是蛋白水解级联反应中的u PA和t PA。这两种丝氨酸蛋白酶都可将纤维蛋白溶酶原激活成为纤维蛋白溶酶，其中u PA作用生成的纤维蛋白溶酶参与ECM的降解，因此，其在肿瘤转移中发挥作用。肿瘤侵袭和转移中的尿激酶系统在其他章节有更详细的讨论，故这里只作简单介绍，主要强调如何参与到蛋白水解级联反应中。

u PA前体活化成为u PA由弹性蛋白酶、组织蛋白酶B和纤维蛋白溶酶介导(图5-6)，并有可能依赖u PA绑定到u PAR［115］。u PA的主要作用是产生纤维蛋白溶酶，从而导致ECM重构，但它也可以激活组织蛋白原B(procathepsin B)［24］，导致另一个反馈回路。u PAR强烈受缺氧诱导，即依赖于缺氧诱导因子(HIF)-1α，因此它与缺氧增加肿瘤细胞侵袭性的机制有关［18］。多项证据显示u PA/u PAR系统在转移中的作用，但这里值得注意的是激活所需的复杂的肿瘤微环境，其中u PAR-u PA-MMP-2途径的激活需要胰腺癌细胞和基质细胞的直接作用［116］。u PA和t PA的两个主要抑制剂是PAI-1和PAI-2(又分别称丝氨酸蛋白酶抑制剂E1和丝氨酸蛋白酶抑制剂B2)。需要注意的是，缺氧上调u PAR及导致增加入侵的同时，通过缺氧也可强烈诱导产生PAI-1［117］。这些结果表明，要想弄清肿瘤细胞在转移过程中的蛋白水解平衡仍有很长的路要走。

分泌型蛋白酶:如前所述，肿瘤细胞和基质细胞可分泌若干蛋白酶(包括组织蛋白酶B和D)，为的是能够降解ECM成分(如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白原和弹性蛋白)，裂解细胞表面的蛋白质，并释放强效生长因子促进血管生成和肿瘤生长。另一个已证实的组织蛋白酶B、L和S细胞表面的重要靶点是E-钙黏蛋白(E-Cad)(图5-7)。小鼠和人类的许多浸润性肿瘤中都已观察到E-Cad的下调。除了突变和转录沉默之外，蛋白水解循环在这个过程中也发挥重要作用［118-121］。生化实验表明，组织蛋白酶B、L和S都能够切割E-Cad;同时遗传学实验表明，缺乏组织蛋白酶B、L或S(而不是组织蛋白酶C)的小鼠无法下调肿瘤细胞的E-Cad表达，导致肿瘤侵袭性减弱［54］。E-Cad的缺失可导致细胞与细胞间黏附的缺失，有利于肿瘤细胞脱离微环境并转移到远处组织［122］。此外，通过组织蛋白酶B裂解纤连蛋白产生的CS-1序列，它可以绑定和激活整合受体α4β1，并控制细胞黏附［111］。

中性粒细胞弹性蛋白酶被分泌到肿瘤微环境中，为其进一步激活组织蛋白酶B、u PA或基质金属蛋白酶以及降解ECM创造了机会。另外，NE的两个重要目标是EGF和TGF-α［123，124］。这种相互作用使得NE从细胞膜上释放EGF和TGF-α，并随后结合自己的目标受体从而刺激增殖。因此抑制NE的活动，对于过度表达EGFR的肿瘤是至关重要的，如某些乳腺癌和肺癌的亚型。NE的内源性抑制是通过在ECM中发现的一些蛋白酶抑制剂，如A11-抗胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶抑制剂、A2-巨球蛋白和分泌型白细胞蛋白酶抑制剂来实现的［125，126］。

肿瘤微环境中的主要分泌蛋白酶的成分组件当然是MMPs和纤维蛋白溶酶。除了弗林蛋白酶可激活MMPs以外，大多数MMPs在细胞外被激活，并且MMPs可作用于许多ECM的组成成分，包括蛋白多糖、胶原蛋白、层粘连蛋白、明胶、纤连蛋白、内功素和弹性蛋白。在癌基因缺失的情况下，MMP-3的过度表达仍可以驱动肿瘤的发生和进展，这种情况通常不会发生在其他蛋白酶上［127］。MMP对ECM活动由4个TIMPs调节，MMP促肿瘤活性和抗肿瘤活性之间的平衡取决于肿瘤的类型和所在的微环境(在其他章节有更详细的讨论)。除了MMP可能具有促瘤和抗瘤两方面功能外，TIMP1的反义抑制促进异种移植模型黑色素瘤转移也是令人惊讶的发现［128］。然而，大多数关于TIMPs的研究已经证实，在许多不同背景和不同类型的肿瘤，TIMPs有抵抗肿瘤生长和转移的保护功能［127，129，130］。此外，TIMP的表达普遍与肿瘤的较低侵袭性及较好预后相关［129］。

通过u PA将纤维蛋白溶酶原激活成为纤维蛋白溶酶后，纤维蛋白溶酶可降解许多不同的ECM成分，包括纤连蛋白、玻璃体结合蛋白、纤维蛋白。值得注意的是，纤维蛋白溶酶原还可以激活一些细胞因子和生长因子的前体［131］。

(3) 尚未解决的关键性问题

虽然在蛋白水解级联反应中各种不同的蛋白酶的相互作用大部分已通过生化技术被阐明，但有关肿瘤及其转移蛋白酶的调节作用的认识仍然处于起步阶段。随着时间的推移，除了体内蛋白酶上调或被抑制的不同机制，更多的相互作用和作用靶点也会被发现。

半胱氨酸蛋白酶的上调和易位:如前所述，多种肿瘤中发现的一个关键变化是组织蛋白酶D和半胱氨酸蛋白酶的表达增加，以及它们从溶酶体细胞质向细胞表面的易位。虽然已知有几种基因可能上调组织蛋白酶的表达，但没有发现直接且特异性发挥该作用的转录因子。组织蛋白酶家族成员往往在肿瘤形成的早期表达上调［132-134］，同时在整个肿瘤发展过程中不断增长［52］，这表明它们的上调可能对肿瘤的进展和转移有重要作用。

虽然组织蛋白酶B已在肿瘤细胞的小窝(caveolae)中发现，但是其易位和分泌的途径仍在调查中。Bonnie Sloane研究组提出小窝途径在这个过程中发挥主要作用，而S100A10对组织蛋白酶前体在细胞表面的活化十分重要［135］。一项体外实验支持这个观点:小窝蛋白1的下调会导致组织蛋白酶B、S100A10和u PA前体之间联系的减少，从而减少胶原蛋白IV的降解［106］。然而，组织蛋白酶从溶酶体定向到小窝的机制目前仍不清楚。组织蛋白酶从溶酶体向细胞表面的易位，对其底物相互作用有很大影响，使其可接触蛋白酶和ECM蛋白的前体，该步骤无法在细胞的其他位置完成。降解ECM成分或激活基质降解的蛋白质，使组织蛋白酶能够显著提高肿瘤转移性进展。此外，肿瘤细胞和基质细胞，尤其是巨噬细胞都可以分泌组织蛋白酶，使得问题更加复杂——他们是在相同的机制下，还是特定细胞类型的特定机制下来促进肿瘤的发展。

不同类肿瘤的蛋白酶活性和作用的差异:了解蛋白水解级联反应的另一个重要问题是，在不同类型肿瘤中蛋白酶的表达和活性存在差异。如组织蛋白酶B、D和某些MMPs，与多种肿瘤的进展和转移有关系，因此作为治疗肿瘤潜在靶点方面具有广阔的应用前景。还有一些蛋白酶在特殊癌症类型或生态微环境中表现出非常密切的相关性(已被证明有因果关系的影响)。例如，由破骨细胞表达并可以进行调解骨吸收的组织蛋白酶K，其在黑色素瘤、乳腺癌和前列腺癌的骨转移中都发挥作用［136-138］。与特定肿瘤类型相关的一种蛋白酶的典型代表是前列腺特异性抗原(PSA)，其作为一种丝氨酸蛋白酶(又称激肽释放酶3)，近年已作为前列腺癌的预后因子［139］。这使大家注意到一些蛋白酶除了作为潜在的治疗靶点，还可能作为预后指标。然而，前列腺癌PSA的特异性目前正面临挑战，因为新的研究表明PSA水平也可能在乳腺癌中具有预测功能［140］。有趣的是，肿瘤特异性蛋白酶仅针对特定的肿瘤微环境，而对正常器官的毒性降至最低。

另一个具有挑战性的是，在某些肿瘤中具有肿瘤促进功能的蛋白酶，在其他癌症中却表现出肿瘤抑制或与其相关的功能。例如组织蛋白酶L，发现在胰腺癌小鼠模型中有促瘤作用［54］，但在结肠癌模型中具有抑制肿瘤作用［63］。其他还包括hepsin［141，142］、MMP-3［127，143］、MMP-9［144，145］和MMP-12［146，147］。我们认为，严格控制实验条件的小鼠模型可用于解决这些基因与肿瘤发生和转移的因果关系，其中确定蛋白酶在何种环境下促进或抑制癌症的发展这一点至关重要。

基质与肿瘤细胞的贡献:由于已证实基质来源蛋白酶在肿瘤生长和转移中的作用，促使肿瘤相关蛋白酶作用机制的研究迅速发展(图5-7)。经常发现血管内皮细胞、成纤维细胞和浸润的免疫细胞在肿瘤微环境下某些基质降解酶表达水平增高，这些降解酶包括半胱氨酸蛋白酶［52，54］、肝素酶［148］、各种基质金属蛋白酶［144，149］和u PA［150］。通常情况下，肿瘤细胞和基质细胞通过各种趋化因子互相传递信号引起蛋白酶的上调，导致ECM的重塑和肿瘤细胞的侵袭，并释放一些生长因子。在这些过程中涉及的趋化因子正在不断增多，包括CCL5［151，152］、CCL9［153］、CSF-1［154］、CXCL12/SDF-1［155］、CXCL8、CXCL1-3等，以及CCL2/单核细胞趋化蛋白-1［152］。肿瘤细胞和基质细胞之间通过趋化因子实现对蛋白水解酶活动的调节，有可能通过阻断趋化因子及其受体间接控制蛋白水解酶活动。

还有两个方面的问题需要说明。首先，一些趋化因子以前体形式合成，并要求蛋白水解裂解来达到充分激活。同样，这类趋化因子的种类仍在增多，其中包括几个CXCL和CCL的配体［156，157］，且已证明过程中起作用的蛋白酶也各不相同，其中包括几种基质金属蛋白酶、u PA、纤维蛋白溶酶、二肽基肽酶IV和一些蛋白酶［157］。作用于靶蛋白酶可能不仅仅是直接阻断肿瘤进展中ECM的重塑和入侵，也可通过干扰趋化因子激活而减少基质细胞的募集而间接干扰肿瘤进展。

其次，了解基质细胞的蛋白水解作用的一大挑战是肿瘤细胞表达通常由基质细胞产生的蛋白酶的能力。如前所述，一个典型例子是由几个不同的肿瘤细胞株NE的表达。在这种情况下，在肿瘤微环境内抑制特异性蛋白酶可能会比针对特定的细胞类型更为有利。

靶标激活与降解能力的冗余:利用蛋白水解抑制作为一种有效的抗癌疗法其最大的挑战也许是蛋白水解旁路的交叉互补。可以从图5-6中看出，一些下游蛋白酶前体可以由多个上游蛋白激活，意味着一个蛋白酶的抑制很容易由另一个蛋白酶补偿。此外，ECM重构可由多种蛋白酶作用产生。ECM成分可以通过多种蛋白酶降解的例子比比皆是，如胶原蛋白可以由多种基质金属蛋白酶和组织蛋白酶降解，纤连蛋白可由纤维蛋白溶酶、组织蛋白酶和MMPs降解，弹性蛋白可由弹性蛋白酶、组织蛋白酶和MMPs降解等。这种功能的冗余需要以蛋白酶家族为单位来研究蛋白水解级联反应。正如Gocheva、Joyce等从事的一项研究，在胰岛癌组织中，利用蛋白酶B、C、L和S基因敲除小鼠，对多个半胱氨酸蛋白酶家族成员在癌症发展的多个方面的作用进行了研究，确定了单个蛋白酶的作用，但也揭示了一些蛋白酶功能的重叠［54］。肿瘤蛋白酶谱分析可能将确定(多个)蛋白酶为目标，而不是试图针对个别蛋白酶来抑制肿瘤的进展。

有关相互作用的体外数据和体内数据的优劣对比:以蛋白水解级联反应为靶点的临床前期或临床模型的最大困难之一是缺乏体内蛋白酶与底物相互作用的数据，这些相互作用至今只经过生化方法确定。虽然在体外实验中描述蛋白质相互作用相当重要，但很少能够完全复制出肿瘤微环境的细胞复杂性。因此，可能因为重要的辅助因子缺乏而导致相互作用的假阴性，或因为内源性抑制剂的缺乏而导致假阳性。此外，在体外的相互作用，可能没有考虑细胞或肿瘤微环境中的蛋白酶和底物的区域分割。因此，在体外观察到有相互作用的两种蛋白质可能在体内甚至从未接触到对方。最后，生化实验条件可能会导致比在体内发现的更强或更弱的结合系数，造成高估或低估强度及互动的重要性。

此外，通过体内研究虽然已证明有几个蛋白酶在肿瘤进展中有抑制或提高蛋白水解酶活性的作用，很少有研究期待超越基本的生理效应，以确定蛋白水解级联反应中蛋白酶的行为。蛋白酶对调节血管生成、ECM重构或细胞增殖的作用不应被削弱。然而，阐明促进或抑制这些活动有关的直接相互作用的合作伙伴将为蛋白水解网络提供不可估量的数据。最近的一项表明组织蛋白酶L切割和激活乙酰肝素酶的研究可作为一个例子，研究者利用组织蛋白酶L无效应小鼠体内肝素酶的激活显著降低来提供证据支持生化数据［51］。研究下游蛋白酶在肿瘤中何种蛋白酶抑制或上调时被激活，同样可以提供更多的关于某些生理效应的信息。

由于将体外研究发现转化为体内功能的困难，若干实验室开始挑战研究体内蛋白水解相互作用。大部分实验室使用可以更准确地模拟肿瘤微环境的同位素标记系统和质谱系统揭示蛋白酶底物的相互作用，包括器官和动物整体实验研究［158］。值得注意的是，最初很多工作都集中在基质金属蛋白酶，因此还需要进一步研究来描述体内其他蛋白酶家族在肿瘤及其转移中的水解活动。当然，上述这些工作无疑将使我们更清楚地了解肿瘤微环境中蛋白水解的相互作用，并提供关于治疗肿瘤时何种相互作用可以(或需要)被阻断的重要研究结果。

(盛媛媛译，钦伦秀审校)

参考文献

［1］Zucker S， et al. Critical appraisal of the use of matrixmetalloproteinase inhibitors in cancer treatment. Oncogene，2000，19: 6642.

［2］Coussens LM，et al. Matrix metalloproteinase inhibitors andcancer: trials and tribulations. Science，2002，295: 2387.

［3］Vihinen P，et al. Matrix metalloproteinases as therapeutic targetsin cancer. Curr Cancer Drug Targets，2005，5: 203.

［4］Caravita T，et al. Bortezomib: efficacy comparisons in solid tumorsand hematologic malignancies. Nat Clin Pract Oncol，2006，3: 374.

［5］Palermo C，et al. Cysteine cathepsin proteases as pharmacologicaltargets in cancer. Trends Pharmacol Sci，2008，29: 22.

［6］Lopez-Otin C，et al. Emerging roles of proteases in tumoursuppression. Nat Rev Cancer，2007，7: 800.

［7］Soung YH，et al. Somatic mutations of CASP3 gene in humancancers. Hum Genet，2004，115: 112.

［8］Offman J， et al. Repeated sequences in CASPASE-5 andFANCD2，but not NF1 are targets for mutation in microsatelliteunstableacute leukemia /myelodysplastic syndrome. Mol CancerRes，2005，3: 251.

［9］Lee JW，et al. Mutational analysis of the CASP6 gene in colorectaland gastric carcinomas. APMIS，2006，114: 646.

［10］Soung YH，et al. Inactivating mutations of CASPASE-7 gene inhuman cancers. Oncogene，2003，22: 8048.

［11］Lopez-Otin C，et al. Protease degradomics: a new challenge forproteomics. Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3: 509.

［12］Lane DA，et al. Directing thrombin. Blood，2005，106: 2605.

［13］Gabrijelcic D，et al. Cathepsins B，Hand Lin human breastcarcinoma. Eur J Clin Chem Clin Biochem，1992，30: 69.

［14］Liaudet-Coopman E， et al. Cathepsin D: newly discoveredfunctions of a long-standing aspartic protease in cancer andapoptosis. Cancer Lett，2006，237: 167.

［15］Rochefort H，et al. Overexpression and hormonal regulation of procathepsinD in mammary and endometrial cancer. J SteroidBiochem，1989，34: 177.

［16］Cavailles V，et al. Cathepsin D gene is controlled by a mixedpromoter， and estrogens stimulate only TATA-dependenttranscription in breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA，1993，90: 203.

［17］Laurent-Matha V，et al. Catalytically inactive human cathepsin Dtriggers fibroblast invasive growth. J Cell Biol，2005，168: 489.

［18］Krishnamachary B，et al. Regulation of colon carcinoma cellinvasion by hypoxia-inducible factor 1. Cancer Res，2003，63: 1138.

［19］Hu L，et al. Thrombin up-regulates cathepsin D which enhancesangiogenesis， growth， and metastasis. Cancer Res， 2008，68: 4666.

［20］Capony F，et al. Phosphorylation，glycosylation，and proteolyticactivity of the 52kD estrogen-induced protein secreted by MCF7cells. J Cell Biol，1987，104: 253.

［21］von Figura K，et al. Lysosomal enzymes and their receptors. AnnuRev Biochem，1986，55: 167.

［22］Kornfeld S. Lysosomal enzyme targeting. Biochem Soc Trans，1990，18: 367.

［23］Larsen LB，et al. Procathepsin D cannot autoactivate to cathepsinD at acid pH. FEBS Lett，1993，319: 54.

［24］van der Stappen JW，et al. Activation of cathepsin B，secreted bya colorectal cancer cell line requires low pH and is mediated bycathepsin D. Int J Cancer，1996，67: 547.

［25］Lenarcic B，et al. Cathepsin D inactivates cysteine proteinaseinhibitors，cystatins. Biochem Biophys Res Commun，1988，154:765.

［26］Capony F，et al. Increased secretion，altered processing，andglycosylation of pro-cathepsin D in human mammary cancer cells.Cancer Res，1989，49: 3904.

［27］Rochefort H. Cathepsin D in breast cancer: a tissue markerassociated with metastasis. Eur J Cancer，1992，28A: 1780.

［28］Westley BR，et al. Prognostic value of cathepsin D in breastcancer. Br J Cancer，1999，79: 189.

［29］Foekens JA， et al. Cathepsin-D in primary breast cancer:prognostic evaluation involving 2810 patients. Br J Cancer，1999，79: 300.

［30］Selicharova I，et al. 2-DE analysis of breast cancer cell lines 1833and 4175 with distinct metastatic organ-specific potentials:comparison with parental cell line MDA-MB-231. Oncol Rep，2008，19: 1237.

［31］Li DQ，et al. Identification of breast cancer metastasis-associatedproteins in an isogenic tumor metastasis model using twodimensionalgel electrophoresis and liquid chromatography-ion trapmassspectrometry. Proteomics，2006，6: 3352.

［32］Glondu M，et al. Down-regulation of cathepsin-D expression byantisense gene transfer inhibits tumor growth and experimental lungmetastasis of human breast cancer cells. Oncogene，2002，21: 5127.

［33］Yan S，et al. Transcription of human cathepsin B is mediated bySpl and Ets family factors in glioma. DNA Cell Biol，2000，19: 79.

［34］Dittmer J. The biology of the Etsl proto-oncogene. Mol Cancer，2003，2: 29.

［35］Berquin IM，et al. Differentiating agents regulate cathepsin B geneexpression in HL-60 cells. J Leukoc Biol，1999，66: 609.

［36］Berquin IM，et al. Identification of two new exons and multipletranscription start points in the 5'-untranslated region of the humancathepsin-B-encoding gene. Gene，1995，159: 143.

［37］Yan S，et al. Molecular regulation of human cathepsin B:implication in pathologies. Biol Chem，2003，384: 845.

［38］Dickinson DP. Salivary ( SD-type) cystatins: over one billion yearsin the making - but to what purpose? Crit Rev Oral Biol Med，2002，13: 485.

［39］Szpaderska AM，et al. Spl regulates cathepsin B transcription andinvasiveness in murine B16 melanoma cells. Anticancer Res，2004，24: 3887.

［40］Sameni M，et al. Imaging proteolysis by living human breastcancer cells. Neoplasia，2000，2: 496.

［41］Sameni M，et al. Functional imaging of proteolysis: stromal andinflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging，2003，2: 159.

［42］Campo E，et al. Cathepsin B expression in colorectal carcinomascorrelates with tumor progression and shortened patient survival.Am J Pathol，1994，145: 301.

［43］Castiglioni T，et al. Immunohistochemical analysis of cathepsinsD. B and L in human breast cancer. Hum Pathol，1994，25: 857.

［44］Sinha AA，et al. Localization of a biotinylated cathepsin Boligonucleotide probe in human prostate including invasive cellsand invasive edges by in situ hybridization. Anat Rec，1993，235:233.

［45］Huh CG，et al. Decreased metastatic spread in mice homozygousfor a null allele of the cystatin C protease inhibitor gene. MolPathol，1999，52: 332.

［46］Cox JL， et al. Inhibition of B16 melanoma metastasis byoverexpression of the cysteine proteinase inhibitor cystatin C.Melanoma Res，1999，9: 369.

［47］Kopitz C，et al. Reduction of experimental human fibrosarcomalung metastasis in mice by adenovirus-mediated cystatin C140 overexpression in the host. Cancer Res，2005，65: 8608.

［48］Seth P，et al. Transcription of human cathepsin L mRNA specieshCATL B from a novel alternative promoter in the first intron of itsgene. Gene，2003，321: 83.

［49］Arora S，et al. Identification and characterization of a novel humancathepsin L splice variant. Gene，2002，293: 123.

［50］Skrzydlewska E，et al. Proteolytic-antiproteolytic balance and itsregulation in carcinogenesis. World J Gastroenterol， 2005，11: 1251.

［51］Abboud-Jarrous G，et al. Cathepsin L is responsible for processingand activation of proheparanase through multiple cleavages of alinker segment. J Biol Chem，2008，283: 18167.

［52］Joyce JA，et al. Cathepsin cysteine proteases are effectors ofinvasive growth and angiogenesis during multistage tumorigenesis.Cancer Cell，2004，5: 443.

［53］Reddy VY，et al. Pericellular mobilization of the tissue-destructivecysteine proteinases， cathepsins B， L， and S， by humanmonocyte-derived macrophages. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92: 3849.

［54］Gocheva V，et al. Distinct roles for cysteine cathepsin genes inmultistage tumorigenesis. Genes Dev，2006，20: 543.

［55］Rousselet N，et al. Inhibition of tumorigenicity and metastasis ofhuman melanoma cells by anti-cathepsin L single chain variablefragment. Cancer Res，2004，64: 146.

［56］Katunuma N，et al. Structure-based development of cathepsin Linhibitors and therapeutic applications for prevention of cancermetastasis and cancer-induced osteoporosis. Adv Enzyme Regul.2002，42: 159.

［57］Lah TT，et al. Cathepsin B，a prognostic indicator in lymph nodenegativebreast carcinoma patients: comparison with cathepsin D，cathepsin L，and other clinical indicators. Clin Cancer Res，2000，6: 578.

［58］Lah TT，et al. The expression of lysosomal proteinases and theirinhibitors in breast cancer: possible relationship to prognosis of thedisease. Pathol Oncol Res，1997，3: 89.

［59］Levicar N，et al. Comparison of potential biological markerscathepsin B，cathepsin L，stefin A and stefin B with urokinase andplasminogen activator inhibitor-1 and clinicopathological data ofbreast carcinoma patients. Cancer Detect Prev，2002，26: 42.

［60］Dohchin A，et al. Immunostained cathepsins B and L correlatewith depth of invasion and different metastatic pathways in earlystage gastric carcinoma. Cancer，2000，89: 482.

［61］Friedrich B，et al. Cathepsins B，H，L and cysteine proteaseinhibitors in malignant prostate cell lines， primary culturedprostatic cells and prostatic tissue. Eur J Cancer，1999，35: 138.

［62］Reinheckel T，et al. The lysosomal cysteine protease cathepsin Lregulates keratinocyte proliferation by control of growth factorrecycling. J Cell Sci，2005，118: 3387.

［63］Boudreau F，et al. Loss of cathepsin L activity promotes claudin-1overexpression and intestinal neoplasia. FASEBJ， 2007，21: 3853.

［64］Walz M，et al. Expression of the human Cathepsin L inhibitorhurpin in mice: skin alterations and increased carcinogenesis. ExpDermatol，2007，16: 715.

［65］Brix K，et al. Cysteine cathepsins: cellular roadmap to differentfunctions. Biochimie，2008，90: 194.

［66］Bromme D，et al. Functional expression of human cathepsin S inSaccharomyces cerevisia e. Purification and characterization of therecombinant enzyme. J Biol Chem，1993，268: 4832.

［67］Gatenby RA， et al. Acid-mediated tumor invasion: amultidisciplinaiy study. Cancer Res，2006，66: 5216.

［68］Gillies RJ，et al. MRI of the tumor microenvironment. J MagnReson Imaging，2002，16: 430.

［69］Rofstad EK，et al. Acidic extracellular pH promotes experimentalmetastasis of human melanoma cells in athymic nude mice. CancerRes，2006，66: 6699.

［70］Janoff A，et al. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes.IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclearleukocytes. J Exp Med，1968，128: 1137.

［71］Li FQ，et al. Characterization of mutant neutrophil elastase insevere congenital neutropenia. J Biol Chem，2001，276: 14230.

［72］Horwitz M，et al. Role of neutrophil elastase in bone marrowfailure syndromes: molecular genetic revival of the chalonehypothesis. Curr Opin Hematol，2003，10: 49.

［73］Horwitz M，et al. Hereditary neutropenia: dogs explain humanneutrophil elastase mutations. Trends Mol Med，2004，10: 163.

［74］Watorek W，et al. Neutrophil elastase and cathepsin G: structure，function，and biological control. Adv Exp Med Biol，1988，240: 23.

［75］Schmitt M， et al. Biological and clinical relevancc of theurokinase-type plasminogen activator ( uPA) in breast cancer.Biomed Biochim Acta，1991，50: 731.

［76］Dona M，et al. Hyperforin inhibits cancer invasion and metastasis.Cancer Res，2004，64: 6225.

［77］Inada M，et al. Complete inhibition of spontaneous pulmonarymetastasis of human lung carcinoma cell line EBC-1 by aneutrophil elastase inhibitor ( ONO-5046. Na) . Anticancer Res，1998，18: 885.

［78］Nozawa F，et al. Elastase activity enhances the adhesion ofneutrophil and cancer cells to vascular endothelial cells. J SurgRes，2000，94: 153.

［79］Hornebeck W，et al. Elastogenesis and elastinolytic activity inhuman breast cancer. Biomedicine，1977，26: 48.

［80］Yamashita J， et al. Free-form neutrophil elastase is anindependent marker predicting recurrence in primary breastcancer. J Leukoc Biol，1995，57: 375.

［81］Rilke F，et al. Prognostic significance of HER-2 /neu expression inbreast cancer and its relationship to other prognostic factors. Int JCancer，1991，49: 44.

［82］Yamashita JI，et al. Production of immunoreactive polymorphonuclearleucocyte elastase in human breast cancer cells: possible roleof polymorphonuclear leucocyte elastase in the progression of hu-man breast cancer. Br J Cancer，1994，69: 72.

［83］Yamashita J，et al. Local increase in polymorphonuclear leukocyteelastase is associated with tumor invasiveness in non-small cell lungcancer. Chest，1996，109: 1328.

［84］de Cicco RL， et al. Inhibition of proprotein convertases:approaches to block squamous carcinoma development andprogression. Mol Carcinog，2007，46: 654.

［85］Leduc R，et al. Activation of human furin precursor processingendoprotease occurs by an intramolecular autoproteolytic cleavage.J Biol Chem，1992，267: 14304.

［86］Vey M，et al. Maturation of the trans-Golgi network protease furin:compartmentalization of propeptide removal，substrate cleavage，and COOH-terminal truncation. J Cell Biol，1994，127: 1829.

［87］Creemers JW，et al. Endoproteolytic cleavage of its propeptide is aprerequisite for efficient transport of furin out of the endoplasmicreticulum. J Biol Chem，1995，270: 2695.

［88］Anderson ED，et al. Activation of the furin endoprotease is amultiple-step process: requirements for acidification and internalpropeptide cleavage. EMBO J，1997，16: 1508.

［89］Konoshita T，et al. Expression of PC2 and PC1 /PC3 in humanpheochromocytomas. Mol Cell Endocrinol，1994，99: 307.

［90］Creemers JW，et al. Expression in human lung tumor cells of theproprotein processing enzyme PC1 /PC3. Cloning and primarysequence of a 5 kb cDNA. FEBS Lett，1992，300: 82.

［91］Cheng M，et al. Pro-protein convertase gene expression in humanbreast cancer. Int J Cancer，1997，71: 966.

［92］Bassi DE，et al. Elevated furin expression in aggressive humanhead and neck tumors and tumor cell lines. Mol Carcinog，2001，31: 224.

［93］Chen RN，et al. Thyroid hormone promotes cell invasion throughactivation of furin expression in human hepatoma cell lines.Endocrinology，2008，149: 3817.

［94］Scamuffa N，et al. Selective inhibition of proprotein convertasesrepresses the metastatic potential of human colorectal tumor cells. JClin Invest，2008，118: 352.

［95］Ra HJ，et al. Control of matrix metalloproteinase catalytic activity.Matrix Biol，2007，26: 587.

［96］Strongin AY，et al. Mechanism of cell surface activation of 72-kDatype IV collagenase. Isolation of the activated form of themembrane metalloprotease. J Biol Chem，1995，270: 5331.

［97］Cao J，et al. Membrane type matrix metalloproteinase 1 activatespro-gelatinase A without furin cleavage of the N-terminal domain. JBiol Chem，1996，271: 30174.

［98］Cirman T，et al. Selective disruption of lysosomes in HeLa cellstriggers apoptosis mediated by cleavage of Bid by multiple papainlikelysosomal cathepsins. J Biol Chem，2004，279: 3578.

［99］Barry M，et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing bydirectly cleaving Bid. Mol Cell Biol，2000，20: 3781.

［100］Chen M，et al. Bid is cleaved by calpain to an active fragment invitro and during myocardial ischemia /reperfusion. J Biol Chem，2001，276: 30724.

［101］Mandic A，et al. Calpain-mediated Bid cleavage and calpainindependentBak modulation: two separate pathways in cisplatininducedapoptosis. Mol Cell Biol，2002，22: 3003.

［102］Gil-Parrado S， et al. Ionomycin-activated calpain triggersapoptosis. A probable role for Bcl-2 family members. J BiolChem，2002，277: 27217.

［103］Guicciardi ME，et al. Bid is upstream of lysosome-mediatedcaspase 2 activation in tumor necrosis factor alpha-inducedhepatocyte apoptosis. Gastroenterology，2005，129: 269.

［104］Stupack DG，et al. Potentiation of neuroblastoma metastasis byloss of caspase-8. Nature，2006，439: 95.

［105］Linder S. The matrix corroded: podosomes and invadopodia inextracellular matrix degradation. Trends Cell Biol， 2007，17: 107.

［106］Cavallo-Medved D，et al. Caveolin-1 mediates the expression andlocalization of cathepsin B，pro-urokinase plasminogen activatorand their cell-surface receptors in human colorectal carcinomacells. J Cell Sci，2005，118: 1493.

［107］Mai J，et al. Human procathepsin B interacts with the annexin IItetramer on the surface of tumor cells. J Biol Chem，2000，275:12806.

［108］Eeckhout Y， et al. Further studies on the activation ofprocollagenase，the latent precursor of bone collagenase. Effectsof lysosomal cathepsin B， plasmin and kallikrein， andspontaneous activation. Biochem J，1977，166: 21.

［109］Murphy G，et al. Physiological mechanisms for metalloproteinaseactivation. Matrix Suppl，199-2，1: 224.

［110］Schmitt M，et al. Tumor-associated urokinase-type plasminogenactivator: biological and clinical significance. Biol Chem HoppeSeyler，1992，373: 611.

［111］Ugarova TP，et al. Proteolysis regulates exposure of the IIICS-1adhesive sequence in plasma fibronectin. Biochemistry，1996，35: 10913.

［112］Buck MR，et al. Degradation of extracellular-matrix proteins byhuman cathepsin B from normal and tumour tissues. Biochem J，1992，282 ( Pt 1) : 273.

［113］Vasiljeva O，et al. Tumor cell-derived and macrophage-derivedcathepsin B promotes progression and lung metastasis of mammarycancer. Cancer Res，2006，66: 5242.

［114］Borchers AH，et al. Paracrine factor and cell-cell contactmediatedinduction of protease and c-ets gene expression inmalignant keratinocyte /dermal fibroblast cocultures. Exp CellRes，1994，213: 143.

［115］Behrendt N，et al. The structure and function of the urokinasereceptor，a membrane protein governing plasminogen activation onthe cell surface. Biol Chem Hoppe Seyler，1995，376: 269.

［116］He Y，et al. Interaction between cancer cells and stromalfibroblasts is required for activation of the uPAR-uPA-MMP-2cascade in pancreatic cancer metastasis. Clin Cancer Res，2007，13: 3115.

［117］Fink T，et al. Identification of a tightly regulated hypoxiaresponseelement in the promoter of human plasminogen activatorinhibitor-1. Blood，2002，99: 2077.

［118］Vleminckx K， et al. Genetic manipulation of E-cadherinexpression by epithelial tumor cells reveals an invasion suppressorrole. Cell，1991，66: 107.

［119］Perl AK，et al. A causal role for E-cadherin in the transition fromadenoma to carcinoma. Nature，1998，392: 190.

［120］Beavon IR. The E-cadherin-catenin complex in tumourmetastasis: structure，function and regulation. Eur J Cancer，2000，36: 1607.

［121］Noe V，et al. Release of an invasion promoter E-cadherinfragment by matrilysin and stromelysin-1 . J Cell Sci，2001，114:111.

［122］Guarino M. Epithelial-mesenchymal transition and tumourinvasion. Int J Biochem Cell Biol，2007，39: 2153.

［123］di Camillo SJ，et al. Elastase-released epidermal growth factorrecruits epidermal growth factor receptor and extracellular signalregulatedkinases to down-regulate tropoelastin mRNA in lungfibroblasts. J Biol Chem，2002，277: 18938.

［124］Kohri K，et al. Neutrophil elastase induces mucin production byligand-dependent epidermal growth factor receptor activation. AmJ Physiol Lung Cell Mol Physiol，2002，283: L531.

［125］Travis J，et al. Human plasma proteinase inhibitors. Annu RevBiochem，1983，52: 655.

［126］Janoff A . Elastase in tissue injury. Annu Rev Med，1985，36: 207.

［127］Sternlicht MD，et al. The stromal proteinase MMP3 /stromelysin-1promotes mammary carcinogenesis. Cell，1999，98: 137.

［128］Koop S，et al. Overexpression of metalloproteinase inhibitor inB16F10 cells does not affect extravasation but reduces tumorgrowth. Cancer Res，1994，54: 4791.

［129］Henriet P，et al. Tissue inhibitors of metallopro-teinases ( TIMP)in invasion and proliferation. APMIS，1999，107: 111.

［130］Kruger A，et al. Host TIMP-1 overexpression confers resistance toexperimental brain metastasis of a fibrosarcoma cell line.Oncogene，1998，16: 2419.

［131］Rifkin DB，et al. Proteolytic control of growth factor availability.APMIS，1999，107: 80.

［132］Hughes SJ，et al. A novel amplicon at 8p22-23 results inoverexpression of cathepsin B in esophageal adenocarcinoma.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95: 12410.

［133］Fernandez PL，et al. Expression of cathepsins B and S in theprogression of prostate carcinoma. Int J Cancer，2001，95: 51.

［134］Nagler DK，et al. Up-regulation of cathepsin X in prostate cancerand prostatic intraepithelial neoplasia. Prostate，2004，60: 109.

［135］Mohamed MM， et al. Cysteine cathepsins: multifunctionalenzymes in cancer. Nat Rev Cancer，2006，6: 764.

［136］Quintanilla-Dieck MJ，et al. Cathepsin K in melanoma invasion.J Invest Dermatol，2008，128: 2281.

［137］Le Gall C，et al. A cathepsin K inhibitor reduces breast cancerinducedosteolysis and skeletal tumor burden. Cancer Res，2007，67: 9894.

［138］Brubaker KD，et al. Cathepsin K mRNA and protein expressionin prostate cancer progression. J Bone Miner Res，2003，18: 222.

［139］Diamandis EP. Prostate-specific antigen: its usefulness in clinicalmedicine. Trends Endocrinol Metab，1998，9: 310.

［140］Narita D，et al. Prostate-specific antigen may serve as apathological predictor in breast cancer. Rom J Morphol Embryol，2008，49: 173.

［141］Klezovitch O，et al. Hepsin promotes prostate cancer progressionand metastasis. Cancer Cell，2004，6: 185.

［142］Srikantan V，et al. HEPSIN inhibits cell growth /invasion inprostate cancer cells. Cancer Res，2002，62: 6812.

［143］McCawley LJ，et al. A protective role for matrix metalloproteinase-3 in squamous cell carcinoma. Cancer Res，2004，64: 6965.

［144］Coussens LM，et al. MMP-9 supplied by bone marrow-derivedcells contributes to skin carcinogenesis. Cell，2000，103: 481.

［145］Scorilas A，et al. Overexpression of matrix-metalloproteinase-9 inhuman breast cancer: a potential favourable indicator in nodenegativepatients. Br J Cancer，2001，84: 1488.

［146］Gorrin-Rivas MJ，et al. Mouse macrophage metalloelastase genetransfer into a murine melanoma suppresses primary tumor growthby halting angiogenesis. Clin Cancer Res，2000，6: 1647.

［147］Hofmann HS，et al. Matrix metalloproteinase-12 expressioncorrelates with local recurrence and metastatic disease in nonsmallcell lung cancer patients. Clin Cancer Res，2005，11: 1086.

［148］Joyce JA，et al. A functional heparan sulfate mimetic implicatesboth heparanase and heparan sulfate in tumor angiogenesis andinvasion in a mouse model of multistage cancer. Oncogene，2005，24: 4037.

［149］Giraudo E，et al. An amino-bisphosphonate targets MMP-9-expressing macrophages and angiogenesis to impair cervicalcarcinogenesis. J Clin Invest，2004，114: 623.

［150］Hildenbrand R，et al. Urokinase plasminogen activator receptor( CD87) expression of tumor-associated macrophages in ductalcarcinoma in situ，breast cancer，and resident macrophages ofnormal breast tissue. J Leukoc Biol，1999，66: 40.

［151］AllaVena P，et al. The inflammatory microenvironment in tumorprogression: the role of tumor-associated macrophages. Crit RevOncol Hematol，2008，66: 1.

［152］Payne AS，et al. The role of chemokines in melanoma tumorgrowth and metastasis. J Invest Dermatol，2002，118: 915.

［153］Kitamura T，et al. Keeping out the bad guys: gateway to cellulartarget therapy. Cancer Res，2007，67: 10099.

［154］Zins K，et al. Colon cancer cell-derived tumor necrosis factor-alpha mediates the tumor growth-promoting response inmacrophages by up-regulating the colony-stimulating factor-1pathway. Cancer Res，2007，67: 1038.

［155］Bonfil RD，et al. Proteases，growth factors，chemokines，and themicroenvironment in prostate cancer bone metastasis. Urol Oncol，2007，25: 407.

［156］Overall CM，et al. Tumour microenvironment-opinion: validatingmatrix metalloproteinases as drug targets and anti-targets forcancer therapy. Nat Rev Cancer，2006，6: 227.

［157］van Damme J，et al. Chemokine-protease interactions in cancer.Semin Cancer Biol，2004，14: 201.

［158］Doucet A，et al. Quantitative degradomics analysis of proteolyticpost-translational modifications of the cancer proteome. Mol CellProteomics，2008，7: 1925.

［159］Joyce JA . Therapeutic targeting of the tumor microenvironment.Cancer Cell，2005，7: 513.

［160］Gocheva V，et al. Cysteine cathepsins and the cutting edge ofcancer invasion. Cell Cycle，2007，6: 60.