转移前壁龛

◎Marianna Papaspyridonos，David Lyden，Rosandra V. Kaplan

近年来，局限性恶性肿瘤的治疗取得了重大进展，而转移仍然是导致肿瘤发病和死亡的首要因素。Steven Paget关于转移的“种子-土壤”学说首次提出了一个概念，即恶性肿瘤细胞向远处组织器官的转移播散需要一个营养微环境。从那以后，100多年来，人类对原发瘤微环境的认识不断深入。然而，直到最近，Paget学说提到的在远处转移部位的局部细胞背景的病理生理学(或称为“壁龛”)方面的发展才引起广泛关注。

在进入循环系统的几百万肿瘤细胞中，只有极少能最终在继发部位进行植入、存活并繁衍［1-4］。已经明确的转移过程效率低被认为是由于大多数扩散肿瘤细胞无法在远处转移部位成功启动生长的结果［5］。肿瘤细胞在到达远处转移靶位后，其存活和繁殖的效率是决定肿瘤转移成功与否的主要因素，并且需要一个能接纳肿瘤细胞的微环境。

在干细胞生物学中，“壁龛”(niche)描述的是干细胞赖以生存和维持的特殊微环境，它可调控干细胞繁殖和休眠之间的平衡［6］。转移过程早期阶段的研究发现，早在肿瘤细胞到达之前，将要发生转移的组织器官就已经发生了独特的变化，包括产生转移壁龛样热点区域。成群的骨髓衍生细胞(BMDC)聚集起来并与宿主间质细胞发生相互作用形成了上述壁龛的异变，也因此为后续肿瘤细胞的播种和生长创造了微环境条件［7-10］(图5-14)。例如，在诸如肺等器官中，转移前壁龛由未成熟髓样细胞组成。其特征包括表达 VEGFR1、CD11b、c-kit 以及最近发现的趋化因子S100A9和S100A8［9-12］。

在原发瘤分泌的VEGF、胎盘生长因子(Pl GF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等影响下，BMDC趋于聚集在纤维结合蛋白增多的区域。而纤维结合蛋白的上调被认为是由成纤维细胞对肿瘤分泌因子的反应所致［8］。VEFGR1+的BMDC表达整合素VLA-4(α4β1)，从而使之能够与层粘连蛋白结合并启动细胞簇的形成。骨髓来源的髓样细胞分泌的MMP-9进一步促进胞外基质重塑，从而加速更多髓样细胞的外渗以及随后肿瘤细胞进入到壁龛中［9］。

最近发现赖氨酰氧化酶(LOX)也参与了胞外基质重塑过程。LOX是一种肿瘤细胞分泌的氨基氧化酶，可诱导基膜中胶原蛋白Ⅳ的交联反应［13］。LOX通过交联的Ⅳ型胶原蛋白与CD11b+细胞结合，促进CD11b+髓样细胞的募集，并分泌MMP-2。胶原蛋白在MMP-2作用下的裂解可促进BMDC的募集与侵袭，从而使转移的肿瘤细胞能顺利到达并植入靶位［11］。

图5-14 已预先接受GFP+骨髓移植小鼠侧腹部注射m Cherry标记的B16肿瘤细胞18天后的肺组织

注: 可见m Cherry B16肿瘤细胞(红色)黏附于GFP+骨髓衍生细胞簇(绿色)，蓝色所示为细胞核(放大倍数为×200)。

VEGFR1+的BMDC与层粘连蛋白、间质细胞和蛋白水解酶一起，通过上调如SDF-1等各种整合素和趋化因子的表达改变局部的微环境，从而提高肿瘤细胞的黏附、存活和生长能力。更重要的是，在肿瘤细胞植入后不久，VEGFR2+EPC(内皮祖细胞)就被募集以提高血管生成能力，于是在转移前壁龛中形成一个完整成熟的转移灶［8］。VEGFR2+BMDC的渗入是转移过程中血管性转变的标志，表明在转移位置已经形成了血管化肿瘤［14］。

利用VEGF受体单克隆抗体试验可解释转移进程对肿瘤植入部位变化的依赖性。应用VEGFR1的中和抗体消除转移前壁龛，而使用VEGFR2特异性抗体允许无血管化的微转移灶形成，可用于阻断完整转移灶的形成［8］。这些实验强调，在发动转移及为新血管生成和转移瘤的生长招募EPC过程中，VEGFR1+非成熟髓样细胞的重要作用。与肿瘤相关成纤维细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过创造有利肿瘤生长的微环境来促进肿瘤发生发展相似，VEGFR1+BMDC在远处转移的器官组织中，也通过类似的方法诱导炎症发生和维持肿瘤生长［15-17］。事实上，这些BMDC在转移位置本身就具有向肿瘤相关巨噬细胞分化的能力，并募集骨髓来源的内皮细胞和成纤维细胞。

5.5.1 肿瘤诱导的缺陷型髓样细胞的分化

已知肿瘤分泌因子通过抑制骨髓来源髓样前体细胞分化和成熟为抗原递呈细胞，从而影响髓样细胞的生成，导致在癌症患者和荷瘤小鼠体内大量未成熟髓样细胞的蓄积。这些不成熟的髓样细胞被认为可通过多条途径促进肿瘤发展，包括抑制淋巴器官中抗肿瘤免疫反应［19-26］和分化成为免疫抑制TAM［27-30］。

形成转移前壁龛的骨髓来源VEGFR1+细胞可能是循环中未成熟髓样细胞的一个亚型，称为骨髓来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)［31］。MDSC的特征包括表达Gr-1和CD11b等标记，可能是影响肿瘤疫苗及抗VEGF疗法等癌症治疗手段疗效的根本原因［32，33］。尽管已有大量有关MDSC功能意义的信息，但在DC和巨噬细胞分化抑制肿瘤的背景下，MDSC聚集的调控机制仍不清楚。在正常情况下，BMDC被认为会迁移到周围器官，并在那里分化成巨噬细胞和DC。但在肿瘤微环境下，各种肿瘤来源的因子(VEGF、IL-6、IL-10、M-CSF和GM-CSF)会阻碍BMDC向完全成熟的免疫细胞分化，并且诱导未成熟的MDSC扩增［34］。

在肿瘤进展过程中髓样细胞分化障碍主要造成3个方面结果:首先是功能活化的DC和巨噬细胞减少。其次，未成熟髓样细胞的大量扩增会通过抑制T细胞活化而抑制免疫反应［35］。第三，不成熟的髓样细胞通过高活性氧(ROS)引起局部类炎症反应的改变，有利于肿瘤细胞进入远处转移靶位［35］。

最近研究发现，在肿瘤中，S100A9和S100A8是促进髓样细胞分化异常的关键因素［36］。S100A9可与S100A8形成二聚体，其中尤其S100A9在DC中的表达被认为是连续性上调的。这两种蛋白质在髓样细胞分化中都发挥非常重要的功能［37］。已有文献证明肿瘤诱导产生的STAT3的表达可上调S100A9水平，而这反过来又对促进MDSC的积累具有非常重要的意义。这可能是肿瘤诱导髓样细胞异常的共同分子机制，它直接把炎症关键通路——STAT3通路和免疫抑制中MDSC的作用联系在一起。此外，S100A8 和S100A9在转移靶位中的上调［9，12］也支持一个理论，即有利于转移前壁龛形成的骨髓衍生性髓样细胞可能构成MDSC的亚型，或者反之亦然。

5.5.2 S100A8与S100A9在转移前壁龛中的作用

最近Hiratsuka等人针对S100A8和S100A9对荷瘤动物肺转移前壁龛形成的作用进行了相关研究［9］。其结果表明，在未成熟的髓样细胞和内皮细胞作用下，这些趋化因子的上调可促进CD11b+髓样细胞进入转移靶位。暴露在肿瘤分泌因子下的CD11b+髓样细胞和内皮细胞与未暴露的这些细胞不同，S100A8和S100A9的表达正提示了这些细胞不成熟的分化状态。此外，S100A8和S100A9的中和抗体可阻碍肿瘤细胞和CD11b+髓样细胞的迁移。这表明S100A8/S100A9通路可能作用于髓样细胞分化、募集和肿瘤细胞的侵袭。

针对S100A8和S100A9功能的后续研究发现，这两种蛋白可引起细胞聚集新的通路［12］。有人提出，这些趋化因子可上调血清淀粉样蛋白(SAA3)，而SAA3通过Toll样受体4(TLR4)和NF-κB来实现趋化因子分泌的正反馈调节作用。这些炎症通路激活所产生的类炎症状态可加速原发肿瘤细胞向肺组织的迁移。因此，阻断转移前阶段SAA3-TLR4的功能可能是有效预防肺转移的策略。

5.5.3 BMDC募集中新的肿瘤分泌因子

骨髓来源髓样细胞的动员和招募被认为是原发肿瘤分泌的趋化因子和促血管生成的细胞因子如VEGF和P1GF (一个血管内皮生长因子家族成员，结合特定的血管内皮生长因子受体如VEGFR-1)作用的结果［8］。一项新的研究通过筛选工作确定与转移癌分泌的巨噬细胞激活因子相关，从而对引发BMDC迁移和转移前壁龛形成的肿瘤分泌蛋白有了进一步了解［38］。对Lewis肺癌(LLC)细胞条件培养基(LCM)的生化分析发现了一个包括肺癌在内多种人类肿瘤中表达上调的细胞外基质多能蛋白聚糖(versican)［39，40］。多能蛋白聚糖被证明是一个通过TLR2及其辅助受体TLR6和CD14发挥作用的强有力的巨噬细胞活化剂。通过激活TLR2-TLR6复合体以及诱导髓样细胞分泌一种血管通透性诱导剂TNF-α，多能蛋白聚糖显著增强LLC的转移性生长。这些发现进一步支持，一些先驱癌细胞侵害了宿主的部分先天免疫系统，包括骨髓来源的髓系祖细胞［8］，从而产生有利于转移生长的炎症微环境。

5.5.4 转移前壁龛的形成:新的治疗靶点

如前所述，控制转移生长是降低肿瘤相关发病率和死亡率的关键。抑制VEGFR2+EPC已经证明可适度有效地控制转移［41］，也包含CD11b+GR-1+细胞的肿瘤对抗VEGF治疗的反应性减弱［33］。已证明胃癌、前列腺癌和大肠癌患者中，VEGFR1表达与转移的风险增加相关［42-45］。正如我们在促炎症状态中所见，VEGFR1表达已被证明是由氧化应激介导的，这可能有助于解释炎症、免疫抑制和转移进展等过程之间的联系［46］。靶向过程，可以在降低肿瘤诱导的免疫抑制和阻碍转移进展两个方面发挥双重作用。血管生成和髓样细胞募集的调控通路之间的密切关系提示，联合阻断VEGFR1和VEGFR2可能比针对单一通路的疗法更有效。联合应用这些受体的中和抗体和小分子抑制剂，可通过受体的细胞内摄作用和自分泌激活机制而避免耐受。除针对VEGFR靶向疗法以外，通过抑制整合素VLA-4、MMPs和Id蛋白来抑制BMDC［8］的药物也可成为有用的辅助治疗，其目的是改变由BMDC建立的微环境。这些靶向免疫调节和阻断血管生成的治疗策略，可更有效地防止肿瘤的转移扩散。

如前所述，最近发现LOX在转移前壁龛的形成中具有重要意义。在人类肿瘤转移灶活检组织中发现CD11b+细胞和LOX有共定位现象，并且LOX表达上调与乳腺癌及头颈部肿瘤患者的较差生存预后相关［11］。更重要的是，抑制LOX活性可预防CD11b+细胞的募集和转移生长。这些表明LOX在转移前壁龛形成中的重要作用，也提示LOX可能是预防转移发生的有效治疗靶点。

已证明VEGFR2、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)和FGFR1的抑制物TSU68，可通过干扰转移前壁龛形成防止原位结肠肿瘤向肝脏的转移［47］。治疗性TSU68可抑制浸润髓样细胞、CXCR2和IL-12等趋化因子的产生，这更强调了髓样细胞的募集在转移生长的开始和发展中的重要性。治疗性抗炎药，如TSU68、抗多能蛋白聚糖或S100A8/S100A9的抗体，或者LOX抑制剂等可抑制血管生成的替代途径，并与抗血管生成剂发挥协同作用，从而阻止转移级联反应的发生。

此外，促进髓样细胞分化［48，49］或防止不成熟髓样细胞蓄积［46］的治疗策略，与化疗药物联合应用［50，51］，可有助于增强抗瘤效用，防止肿瘤进展［35］。

当前及未来对参与转移生长的启动、宿主髓样细胞的分化障碍，以及这些不成熟髓样细胞和肿瘤细胞向远处迁徙转移的肿瘤分泌因子的相关研究，应有助于我们对转移过程的理解并加快发展新型抗肿瘤转移的治疗方法。

5.5.5 结论

目前的研究结果证明，在远处转移靶位，包括不成熟VLA4+VEGFR1+髓系细胞的浸润和炎症通路的激活等细胞或分子事件可加速转移灶的发展。有关转移靶位中肿瘤细胞、肿瘤相关细胞及转移靶点基质间相互作用的许多细节仍有待阐明，被募集到转移靶点的髓样细胞和其他骨髓来源细胞的分子和功能表型特点尚未得到完整的描述，而描述这些分子的表面标记的多变性也有更大难度。不成熟祖细胞和完全分化细胞可能同时参与其中，在包括祖细胞和MDSC在内的各种髓样细胞都表达CD11b和VEGFR1，因此，以上研究可能涉及重叠的细胞亚群。除了以髓样细胞为靶点，以表达层粘连蛋白的成纤维细胞为靶点的治疗方法可能是另一种干预转移进展的途径，可以通过阻止髓样细胞与层粘连蛋白的结合来达到治疗目的。

在转移发展过程中会发生髓样细胞的分化功能失调以及BMDC和其壁龛之间的相互作用等，探索这些现象确切的潜在机制，有助于发展针对异常壁龛形成的特异性治疗方法;识别并抑制促进癌细胞转移的细胞因子和生长因子，可能对阻断早期和晚期肿瘤生长和转移的过程提供额外动力，这种以转移进展为靶点的治疗方式可成为最有效的肿瘤治疗方法。

(盛媛媛译，钦伦秀审校)

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