器官特异性转移的决定因素

◎Yibin Kang

对于肿瘤患者来说，肿瘤发展中重要器官转移的风险给他们带来极大的焦虑感和不确定性。肿瘤细胞释放到全身的血液循环之后，在任何癌栓可以到达的器官都有发生转移的可能。然而，在对肿瘤患者的尸检记录进行大量分析之后表明，在不同的器官中转移的相对分布并不是随机的。某些器官如骨骼、肺、肝，经常成为肿瘤转移的靶点，而其他器官和组织如脾和肌肉，则很少受到影响［1］。

转移的器官亲嗜性(metastasis organotropism)反映了一个证据充分的事实，即每种类型的肿瘤都表现出独特的继发器官转移模式(图5-20)［1，2］。例如，近85%的进展期前列腺癌患者有骨转移;相比之下，晚期结直肠癌患者则主要发生肝转移，很少骨转移。乳腺癌通常转移到骨、肝、肺，至少25%的进展期乳腺瘤患者在诊断时即发现有这些器官的转移(图5-20)，而在尸检时则有超过60%［3］。乳腺肿瘤从原发位点转移到远处器官，如肾、脾或子宫则比较少见。

5.7.1 器官特异性转移的血流动力学和“种子-土壤”假说

两大理论被提出来解释肿瘤转移的器官亲嗜性。由于血行传播是转移扩散的主要途径，原发肿瘤和转移器官之间血管连接的解剖结构可能对转移风险具有重要影响。转移的器官亲嗜性中血管解剖和血流动力学的重要性——血液动力假说——是由美国著名病理学家、纽约纪念斯隆-凯特琳癌症中心创始人James Ewing(1866～1943)提出的。在他极具影响力的教科书《肿瘤性疾病》(Neoplastic Diseases)中，Ewing发现“组织对发生继发肿瘤特别易感，这是转移研究中的有趣阶段……循环机制无疑可以解释这些大部分的特殊性，因为还没有证据表明任何一个实质器官比其他器官更适合肿瘤细胞栓的生长。脾似乎发生肿瘤转移的概率极低。”事实上，血液流动模式至少可以部分解释肠道肿瘤如大肠癌患者发生肝转移机会较多，而前列腺癌患者常发生脊柱骨转移(图5-21)。

图5-20 乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肾癌转移的器官分布格局

注: (A)处于远处转移阶段的几种器官肿瘤初次诊断时，在4个常见转移部位(肺、肝、骨和脑)所占的比例［1］。(B)进展期乳腺癌患者在诊断时的器官分布格局［1］。器官受累的百分比在尸检中往往显著升高(本图中显示的数据来自Hess等的研究［1］，图来自参考文献［2］)。

图5-21 血流模式对不同肿瘤转移器官分布格局的影响

注: 大多数组织的静脉血引流入心脏的右侧，其后进入肺部，而脾和肠道的静脉经肝门静脉直接进入肝脏。因此，多数肿瘤发生肺转移，而大肠癌往往导致肝转移。前列腺癌细胞通过椎旁血管转移到脊柱，在形成骨转移(图来自参考文献［51］)。

血行转移大多是通过动脉循环播种。在血液反回到全身动脉循环之前，静脉循环导致来源于实体肿瘤如乳腺癌的癌栓在肺微血管被捕获。这在很大程度上可以解释转移好发于肺。相比之下，由结直肠癌扩散的肿瘤细胞在到达肺部之前，则优先通过肝-门静脉系统传递到肝脏。因此，结肠癌播散的癌栓在获得向其他内脏器官种植转移的机会之前，有更大的概率被肝脏微血管捕获。类似的，前列腺癌细胞往往通过椎旁的巴斯顿静脉丛转移到脊柱，这可以解释为何晚期前列腺癌患者发生骨转移的概率很高(图5-21)。

虽然血流模式有助于转移，Leonard Wsiss在对16个原发肿瘤和8个转移靶器官之间的转移模式进行深入分析后发现，只有66%的患者原发瘤与继发器官之间的转移能够单独由血流动力学来解释［4］。其余的病例，某些器官比仅依靠血管输入量所预测的更适合转移病灶的生长，而另一些则对转移灶的生长更“不利”。肿瘤细胞与转移器官之间产生积极或消极相互作用的概念被很好地概括为经典的“种子-土壤”假说，这是由英国外科医生Stephen Paget于1889年提出的。他推测，恶性肿瘤细胞从原发肿瘤上脱落并在全身散播，但转移灶的形成只发生在种子(扩散的肿瘤细胞)和土壤(继发器官)相容的时候［5，6］。

种子和土壤相互作用的决定因素可能包括:肿瘤细胞对某些器官的选择性滞留或归巢;某些肿瘤细胞具有的独特性质使其在异位微环境中能够生存和成长;继发器官能够提供特定组合的刺激因子，以促进转移灶的形成。然而，由于器官特异性转移模型的建立相当困难，以及转移性肿瘤基因的复杂性，确定这些特定“种子”或“土壤”的分子特性是一项艰巨的任务。

为研究转移器官亲嗜性，Josh Fidler和他的团队基于20世纪70年代初的观察，即来源于特定位点的转移肿瘤细胞往往表现出对该器官特异增强的转移能力，提出了一项特别富有成效的实验方法［7］。这种器官特异性转移在亲代细胞株中被发现已预先存在，且在体内转移实验中检测到，这种特异性在靶器官内通过Darwinian选择轻易地增强。Joan Massagué、Richard Hynes、Robert Weinberg和其他研究者在动物转移模型中应用DNA芯片分析技术(图5-22)，在体内选定的各种器官特异性转移变异中识别出一系列基因差异性表达［8-13］。在这些器官特异性转移基因标签中确定的许多基因，后来被证明在转移中有重要功能和很高的临床相关性。这些类型的功能基因组研究已大大加快了近年来的器官亲嗜性研究，并为这一神秘现象的机制研究提供了前所未有的见解。在这里，我们将用骨转移和肺转移来阐述促进器官特异性转移的复杂肿瘤与基质间的相互作用。

5.7.2 骨转移:RANK-RANKL-OPG的恶性循环

骨转移已成为转移亲嗜性研究最深入的领域，这主要由于两方面的原因。首先，骨转移常见于许多晚期实体肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌和肺癌。在有肿瘤转移的患者中，多数转移到骨骼［14］，并且骨转移的患者易患衰弱性并发症，如骨折、严重的骨痛、神经压迫和高钙血症。当前可用于骨转移的治疗主要是姑息治疗，迫切需要更有效的治疗方法。其次，正常骨骼的动态平衡由两个独特类型的细胞维持，它们具有相反但紧密联系的功能，即构建骨的成骨细胞和降解骨的破骨细胞。从骨动态平衡研究中获得的知识极大地促进了骨转移的研究，因为骨转移的病理表现显示是由于破骨细胞和成骨细胞活性的微妙平衡被破坏而引起的，最终导致成骨或溶骨性骨病变。

图5-22 组织特异性转移基因的体内鉴定选择方法示意图

注: 实验通常分5个步骤进行:①肿瘤细胞株注入同源或免疫功能低下动物，可通过两个注射途径:原位注射到解剖学相关位点，或直接注射入血液循环。②转移的发展由适当的非侵入性成像技术如X线成像或发光成像来监测。③肿瘤细胞亚系由从转移位点分离的肿瘤细胞建立。④通过在一个新的动物群体进行第二轮注射测试亚系转移潜能的增强。可进行连续几轮的筛选，以获得转移性最强的亚群。⑤在建立并检测足够多的变异细胞系之后，用微阵列分析和统计分析对转移候选基因进行验证，可进一步在动物模型中检验或在人类肿瘤标本中进行免疫组化相关分析(图来自参考文献［52］)。

成骨细胞由间质祖细胞分化而来，间质祖细胞还可分化成肌细胞、脂肪细胞和软骨细胞［15］。其分化主要由Runx2控制，Runx2是在成骨细胞谱系中特别活跃的主转录因子。与此相对，破骨细胞则来源于造血干细胞的单核-巨噬细胞谱系，其分化的重要信号分子包括RANKL和M-CSF。RANKL与破骨细胞前体细胞的受体RANK结合，导致TRAF家族蛋白如TRAF6的招募，TRAF6为通过NF-κB和JNK途径激活促使破骨细胞分化和成熟的基因程序。除了分泌RANKL以激活破骨细胞分化之外，成骨细胞也表达骨保护素(OPG)，这是一种可以结合和隔绝RANKL的诱骗受体，能够防止其对RANK的激活。RANKL和OPG也可以由许多骨微环境中的基质细胞分泌，包括成纤维细胞、活化的T细胞或树突状细胞，以及内皮细胞［16，17］。RANKL和OPG在骨微环境中的相对丰度决定了破骨细胞的相对活性。在正常生理条件下，成骨细胞和破骨细胞功能的相互影响，使体内有活跃的骨重塑(吸收旧骨随后形成新骨)，以保持骨骼系统的力量。这种微妙平衡的破坏，将导致骨质疏松(骨质流失)和石骨症(骨过度增厚)等病理状态。

在骨转移中，破骨细胞和成骨细胞活动的平衡被打破，结果造成骨的完整性受到破坏，有利于扩散肿瘤细胞在骨髓中的增长［14］。前列腺癌患者的骨转移大多数是成骨性的，在肿瘤细胞附近经常发现新骨碎片。乳腺癌可以同时产生溶骨性和成骨性骨转移，但在大多数乳腺癌患者中骨转移是溶骨性的，因为乳腺癌细胞在平衡中更倾向于增强破骨细胞的活性［14，18］。目前认为，乳腺癌细胞不具有进行高度特异性骨吸收的能力。相反，肿瘤细胞分泌的因子可以促进RANKL的产生，并减少成骨细胞和骨基质细胞中OPG的表达，这些骨基质细胞包括肿瘤相关成纤维细胞、免疫细胞(例如，活化的T细胞和巨噬细胞)、血小板和内皮细胞(图5-23)。甲状旁腺激素相关蛋白(PTHr P)是其中的肿瘤分泌因子，它能刺激成骨细胞分泌RANKL。除了PTHr P，肿瘤细胞还能分泌或诱导基质细胞产生其他因子，以促进破骨细胞的形成［14，17，19］，这些因子包括IL-1［20］、IL-8［21］、GM-CSF［22］以及前列腺素E2［23］(图5-22)。

通过对MDA-MB-231乳腺癌细胞系的骨转移源性亚群进行基因组作图分析后发现了“骨转移基因标签”，包括骨桥蛋白( OPN)、CTGF、FGF5、IL-11、CXCR4、MMP-1、ADAMTS1，以及许多其他基因［9，24］。这些基因构成器官特异性“工具箱”，可促进肿瘤细胞在骨中的归巢(由趋化因子受体CXCR4介导)，降解骨基质中的胶原蛋白(由MMP-1介导)，激活破骨细胞(通过IL-11诱导成骨细胞中前列腺素E2的表达;通过MMP-1和ADAMTS1启动的EGFR依赖的旁分泌信号级联通路，抑制成骨细胞中OPG的表达)［25］，促进血管生成(由CTGF和FGF5介导)。对这些骨转移候选基因的验证性实验表明，显著提高低转移细胞的骨转移能力往往需要同时上调多个转移基因的表达［9］。这项研究强调了器官特异性转移的多基因性。

骨基质就像肥沃的土壤，为肿瘤细胞、骨细胞和其他基质成分之间的相互病理作用提供营养。破骨细胞在骨吸收的同时向骨基质中释放大量的生长因子，包括IGF、TGF-β、PDGF和BMP(图5-23)。这些生长因子能刺激肿瘤细胞的生长，并促进骨转移因子如PTHr P、CTGF、IL-11和VEGF的产生，从而在骨转移中形成所谓的恶性循环［14，26，27］。

图5-23 溶骨性骨转移的肿瘤-基质相互作用

注: (A)乳腺癌细胞株MDA-MB-231在无胸腺小鼠后肢形成的典型溶骨性骨转移。组织学图像显示肿瘤细胞(左上)通过激活和招募位于肿瘤细胞和骨表面之间的多核破骨细胞，破坏矿化骨基质(右下)。(B)溶骨性骨转移的恶性循环。骨的动态平衡是由形成骨的成骨细胞和降解骨的破骨细胞之间的平衡维持的。破骨细胞的分化和活化依赖于趋化因子RANKL与前破骨细胞表面受体RANK的结合。RANKL由成骨细胞及其他骨基质细胞，如成纤维细胞、活化的T细胞和树突状细胞、血管内皮细胞等产生。肿瘤细胞产生一系列因子，影响骨和间质细胞并改变骨基质，通常使骨的动态平衡向溶骨性骨质破坏倾斜。这些肿瘤源性因子包括血管生成因子，如FGF和VEGF;免疫细胞调节剂，如TNF-α、TGF-β和GM-CSF;成纤维细胞活化剂，如FGF和TGF-β。一些肿瘤细胞来源的蛋白酶也可直接(如MMP-1/胶原酶Ⅰ)或间接参与骨退化(促进RANKL从细胞表面的溶解)。其他肿瘤来源的细胞因子和细胞表面或ECM中的蛋白质，可促进破骨细胞或成骨细胞的分化、激活、招募(如BMP、IL-11、OPN和内皮素-1)或肿瘤细胞到骨的归巢(如CXCR4)。通过骨溶解从骨基质中释放的生长因子促进肿瘤细胞的生长和恶性表型(图来自参考文献［2］)。

有趣的是，越来越多的证据表明，乳腺癌细胞可能被赋予特殊的内在属性，以有效地参与骨组织的相互作用。乳腺癌细胞激活破骨细胞的能力，与其在正常乳腺组织中的同源细胞——乳腺上皮细胞(MECS)在泌乳时的能力非常相似。为了在乳汁中存入足够的钙质，MECS可以过度表达PTHr P，从而刺激破骨细胞的活性，造成骨的吸收和钙的释放［28］。在小鼠中敲除PTHr P基因后，其哺乳过程中骨质流失明显降低［29］。此外，许多骨细胞发育的关键因子，在乳腺功能和乳腺癌恶化中也起到重要作用。例如，破骨细胞分化因子RANKL可通过NF-κB信号通路激活乳腺上皮细胞中细胞周期蛋白D1的表达，从而在乳腺发育中起重要作用［30，31］，同时该因子也被证明在孕激素诱发的乳腺癌中发挥关键作用［32］。缺乏RANKL或其受体的小鼠，在怀孕期间将不能形成小叶腺泡状的乳腺结构，最终导致新生幼鼠的死亡。研究还发现，RANK也在乳腺癌细胞中表达，并在骨中RANKL的刺激下促进侵袭、迁移和组织特异性骨转移［33］。

Runx2是成骨细胞分化的主要调节因子，存在于新生的乳腺上皮细胞中，有助于哺乳期中β-酪蛋白(β-casein)和OPN的表达［34］。值得关注的是，Runx2被发现在骨转移性乳腺癌细胞中过表达，并能激活骨转移相关的几个基因，如MMP9、OPN、BSP和RANKL［35，36］。在乳腺癌细胞中大量表达负性的Runx2可以显著抑制骨转移［37］。此外，对骨转移性乳腺癌细胞的基因表达分析显示存在高水平骨相关基因的表达［38］，与先前在亲骨性乳腺癌和前列腺癌细胞中描述的拟骨表型是一致的。

总的来说，这些研究强调了恶性乳腺癌的能力，它可利用乳腺组织预先存在的功能或进行表型过渡，以增补或模仿驻留在骨微环境中的细胞。因此，乳腺癌骨转移可以作为支持Stephen Paget“种子-土壤”理论令人信服的一个例子。我们对骨转移分子机制的了解也会带来更好的靶向治疗方法。例如，药物bisphophonates被广泛应用于缓解溶骨性乳腺癌患者的骨质流失和骨痛，因为bisphophonates可通过覆盖在骨基质表面，诱导破骨细胞凋亡，阻止上述恶性循环［14］。其他骨转移抑制剂包括RANKL和PTHr P的封闭抗体、内皮素-1抑制剂、TGF-β抑制剂以及维生素D类似物，目前正在临床试验中。

5.7.3 肺转移:靶向血管内皮和肺转移促进基因

在对肺亲嗜性转移的研究中，大量工作集中在鉴别介导肿瘤细胞向肺血管内皮细胞黏附的细胞间相互作用分子上。当乳腺肿瘤细胞到达肺毛细血管时，由于血管收窄，它们可以被物理性滞留。最近有证据表明，肺中肿瘤细胞的黏附和外渗也是由特定的分子介导的，包括肿瘤细胞表面的黏附分子和血管内皮细胞上的相应受体。趋化因子受体CXCR4和CCR7在人类乳腺癌细胞高表达，能介导这些细胞在大量表达各自配体CXCL12/SDF-1和CCL21的转移位点(如肺、骨和区域淋巴结等)的归巢［39］。Brown等人从小鼠转移性乳腺肿瘤中构建了c DNA噬菌体表达库，以此来识别结合到肺血管的蛋白结构域［40］。从中发现蛋白质异黏蛋白(metadherin)的一个跨膜结构域，通过与肺血管内皮细胞上的一个未知受体结合，介导肿瘤细胞特异性地以肺而非其他器官为靶标［40］。另一项研究显示，乳腺癌细胞对肺血管内皮细胞的黏附作用是由细胞表面表达的α6β4整合素介导的，并能与人类CLCA2蛋白相结合，该蛋白是肺小动脉、动脉、静脉管腔表面内皮细胞上表达的钙敏感氯离子通道蛋白［41］。此外，在大鼠乳腺癌模型中，乳腺癌细胞表面表达的纤连蛋白被证明可与肺内皮细胞上的二肽基肽酶IV(DPPIV)相互作用，从而介导黏附作用［42］。如果这些黏附蛋白中的一个或多个被证明显著地参与到临床肺转移，这些配体和(或)受体的中和肽可被研究用以阻断肺转移。

对来自MDA-MB-231乳腺癌细胞系的肺亲嗜性变异细胞进行基因组分析，发现了一个肺转移基因标签，其中包括EGF家族成员上皮调节蛋白(epiregulin)，细胞黏附分子SPARC和VCAM1、MMP-1、IL-13诱饵受体IL-13Rα2等［43］。这与骨转移的功能基因组学研究中所观察到的一致［9］，在此标签中的单个基因的过度表达只导致肺转移轻微地增强，而多个基因同时表达则对肺转移有显著的促进作用［10］。在这些肺转移相关基因中，EGFR配体上皮调节蛋白、COX2、MMP-1和2被证明能共同促进原发肿瘤中的血管生成以及肿瘤细胞的内渗和外渗，从而促进肿瘤细胞在肺转移位点的定植。很重要的是，当用肺转移的基因标签来分析原发性乳腺肿瘤基因表达谱时，它能成功地区分高风险与低风险的肺转移(而不是骨转移)患者［10］。

目前骨转移和肺转移基因标签之间只有有限的重叠(例如CXCR4和MMP-1)，这表明不同类型的器官特异性转移对功能有不同的要求。然而，已发现几个信号通路在骨和肺转移中都有重要的调节作用。例如，NF-κB被发现在肺转移中非常关键。因此，使用NF-κB通路抑制剂可减少肺转移［44］。NF-κB还可通过分泌破骨细胞分化因子GM-CSF刺激破骨细胞发生，从而促进乳腺癌溶骨性骨转移［22］。TGF-β是溶骨性骨转移恶性循环中重要的骨基质来源“土壤因子”，它能激发骨转移基因，如 PTHr P、IL-11 和CTGF［9，24］的表达，同时也被证明可以促进肺转移［45，46，47］。在乳腺癌发展过程中TGF-β通路可发挥一对相反的作用［48］。它既能抑制正常乳腺上皮细胞增殖并抑制早期癌症，同时也能促进晚期肿瘤的恶变。因此，针对TGF-β通路进行预防或治疗转移的方法，可能只适用于处于特定的晚期治疗窗口的部分肿瘤患者［49-52］。

5.7.4 现有的转移器官亲嗜性模型及其未来发展方向

除了血流动力学的作用以及转移位点“种子-土壤”的相互作用，转移的器官亲嗜性也可能受到很多其他因素的影响，这些将在其他章节中讨论。例如，存在于转移前壁龛中的细胞或分子组分以及器官特异性生存因子，都能使肿瘤细胞在有别于原发肿瘤的外界微环境中避免凋亡。虽然，转移的器官亲嗜性仍然是肿瘤研究中一个有待开发的领域，但对这种现象日益成熟的认识正在形成(图5-24)。癌基因的改造可产生肿瘤起始细胞，继而形成异质性的原发肿瘤。原发瘤可能进一步遗传变异以产生器官亲嗜性转移，或在组织特异性方面保持原样，只发展适宜在继发器官微环境的选择压力下生长的能力。扩散的肿瘤细胞通过全身的血液循环到达多个远处靶器官。血流模式无疑增长了不同器官接收癌栓的相对危险性，也增长了特定类型原发肿瘤发展到转移肿瘤的风险。肿瘤细胞可能会提高趋化因子受体的表达，以挑选出能产生一系列特定趋化因子的适宜靶器官。肿瘤细胞通过特异类型的黏附分子结合到内皮细胞上，从而进一步明确靶器官的特异性。随后，肿瘤细胞渗出、迁移，并最终到达转移前壁龛，原发肿瘤已提前通过远距离动员做好了其归巢的准备。为了在靶器官增殖，肿瘤细胞必须依靠自身的能力以适应宿主器官的微环境，并与器官内多种细胞类型进行有益的互动。

转移的器官亲嗜性是肿瘤研究中最古老的问题之一，由于其在转移性疾病的预防和治疗中的重要意义，在当代也受到了广泛的关注。虽然，近几年对肿瘤器官亲嗜性的研究快速进展，有几个问题仍有待今后的研究加以解决。

1) 每个器官特异性转移所必需的特殊功能组合是哪些? 在不同类型的肿瘤之间有什么区别? 转移细胞中实现这些功能的基因组合是哪些?

2) 我们能否确定转移器官亲嗜性的主要调节因子? 候选的主要调节因子已被提出，如在正常乳腺发育和骨生理中有作用的Runx2。然而，复杂的计算或系统生物学方法将为更迅速全面地识别其他主要调节因子奠定基础。

3) 促转移信号通路，如TGF-β和NF-κB，是否通过不同的下游介质来促进器官特异性转移? 促转移途径的效应分子是什么?

4) 是否可以通过联合应用先进的体内成像技术和基因表达调控技术来改进实验动物模型? 这样的实验平台，将为我们提供许多必要的信息，如转移基因在时间和空间上的要求，使我们能够更准确地评估肿瘤与宿主间的相互作用。这还将促进抗转移试剂的发展和完善，增加其在临床试验中获得成功的机会。

5) 肿瘤起始的肿瘤干细胞和转移器官亲嗜性之间是否存在联系? 肿瘤干细胞的不同细胞来源是否决定了其转移的倾向性，包括转移器官亲嗜性? 不同宿主组织的微环境是否会选择不同种类的肿瘤干细胞? 肿瘤细胞是否利用正常组织干细胞巢向远处器官定植?

图5-24 器官亲嗜性转移的综合模型

注: 肿瘤发生是将正常细胞转变成肿瘤起始细胞(用红色表示，A)，并发展为异质性原发肿瘤(B)。获得总的和器官特异性转移能力后(用不同颜色表示，C)，原发肿瘤发生进一步恶变并开始通过血液循环向身体的不同器官播散(D)。肿瘤细胞到达并停留在特定靶器官的数量，取决于血流模式和肿瘤细胞与靶器官间的分子作用。趋化因子，如SDF1介导过度表达其同源受体的肿瘤细胞进行器官特异性归巢(E)。不同器官的毛细血管床(用不同颜色的血管表示)通过肿瘤细胞和血管内皮细胞的特定黏附作用捕获不同亚群的肿瘤细胞(F)。黏附的肿瘤细胞侵袭穿过内皮细胞层和基膜(G)达到组织的实质。原发瘤释放的刺激因子(H)形成的转移前壁龛，有利于微转移的初步建立(I)。在转移前壁龛中只有转移性CSC被标示出来(I)，因为它们是假设的能够播种继发性肿瘤的唯一细胞。活跃的肿瘤-基质相互作用(J)支持微转移向危及生命的肉眼可见大转移发展(K)(图来自参考文献［2］)。

6) 怎样才能将日益增长的器官特异性转移的知识，转化成为更好的转移性乳腺癌预防和治疗措施? 如何完善测试新型抗转移治疗疗效的临床试验设计?

(魏金旺译，钦伦秀审校)

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