肿瘤转移过程中

◎Julio A. Aguirre-Ghiso，Daniel F. Alonso，Eduardo F. Farias

转移性病变是大多数肿瘤致死的主要原因，因此，了解肿瘤发展到转移阶段过程中肿瘤细胞、可溶性因子、细胞外基质(ECM)以及宿主细胞之间复杂的相互作用，对设计成功的治疗手段至关重要［1］。转移的形成，是指一个或一组细胞离开原发肿瘤位点，在体内远处、解剖学上分离的部位形成一个肿瘤细胞集群［1］。要形成一个明显的转移，细胞必须克服组织环境所施加的调节作用和物理束缚，并开始增殖和浸润性生长。蛋白酶及其抑制剂和受体，如包含尿激酶型纤溶酶原激活剂(u PA)的调节系统，在决定肿瘤细胞的转移能力上发挥了至关重要的作用(图5-25)。有趣的是，u PA及其受体(u PAR)促进的肿瘤细胞播散和转移性增长，可能不仅是由蛋白水解所造成，还与肿瘤细胞获得的新功能有关，该功能与肿瘤细胞靶器官迁移、生存和增殖所必需的细胞信号转导相关［1，2］。u PAR在正常和肿瘤细胞中调节细胞运动的作用类似，这在最近大量的综述中已被提到［3］。本章重点介绍的是u PA系统在肿瘤进展过程中如何调节侵袭、播散、生存和有丝分裂中的蛋白水解和信号转导，同时也介绍以该复合物的水解蛋白和信号属性为靶标设计的治疗策略。

5.8.1 纤溶酶原激活系统

(1) 纤溶酶原激活系统的发现和有关肿瘤的早期开拓性研究

纤溶酶原激活系统是20世纪40年代末，在研究正常纤维蛋白基质降解(纤维蛋白溶解)和血栓形成的实验中被首次发现的［4］。纤维蛋白溶解过程产生纤维基质并控制其降解程度的能力，促使人们开展了对它的研究。在此过程中，无活性的纤溶酶原被组织型(t PA)和(或)尿激酶型(u PA)纤溶酶原激活剂等酶原活化为血纤维蛋白溶酶。在早期的研究中，那些纤维蛋白溶解因子被定义为纤维蛋白激酶。在20世纪70年代初，随着蛋白质高度纯化技术的发展，纤维蛋白溶解过程中涉及的各分子间的相互作用也逐渐被阐明［5，6］。在这段时间里，Reich实验室和其他实验室的研究在很大程度上解释了在正常组织重塑以及癌侵袭转移等病理过程中，纤溶酶原激活剂的酶学和生物学功能［7-9］。结果，从转化的鸡胚成纤维细胞上清液中分离出的u PA，成为有史以来第一个被确认的参与肿瘤相关纤维蛋白溶解过程的蛋白酶［10］。这个开拓性的发现随后被证实为恶性细胞的共同特点，并从此作为肿瘤治疗的潜在靶标进行持续地研究。与u PA相反，t PA与恶性肿瘤没有那么强的联系，但它可能与几个组织的分化状态更有联系［11，12］。PA的发现，其影响已不仅限于肿瘤。一个很好的例子是，t PA和u PA已被临床上作为促纤维蛋白溶解剂用于治疗血栓性疾病［13］。

ECM的降解是组织正常发展、伤口愈合、肿瘤播散和转移的关键过程。在不同组织中ECM的分子组成各不相同。因此，推测负责其加工的分子也存在差异。正常和肿瘤细胞都能产生多种蛋白水解酶，在某些情况下，肿瘤细胞也可以利用基质细胞产生的蛋白水解酶［14］。无论何种来源的蛋白酶，最终都促使肿瘤细胞重塑ECM，支持细胞向其他组织的迁移和侵袭(图5-25和表5-2)。

图5-25 侵袭中运动性和蛋白质水解的协调作用

注: 该图描绘了入侵细胞的突触和分子，以及细胞外、细胞质和细胞核内的信号流。生长因子(GF)受体(RTKs)通过自分泌回路，或通过其受体的激活性基因突变，或由基质释放的生长因子如肝细胞生长因子/扩散因子(HGF /SF)等，与整合素αβ协同激活Ras-ERK通路，导致蛋白酶及其受体，或“对接”分子的持续表达，随后与基质配体相互作用。整合素和GF受体激活途径依赖于GTP酶的Rho家族，通过激活Rho激酶(ROCK)和肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化，造成肌动蛋白细胞骨架重组、收缩和运动。肌动蛋白细胞骨架通过由内到外的信号转导，可以激活整合素并迁移和侵袭中吸纳u PAR、CD44和蛋白酶。用u PAR-u PA-纤溶酶和MMPs控制表面蛋白水解可以为运动清理路径。基质分子或其蛋白水解片段可能作为趋化因子和蛋白酶产生诱导剂。MT-MMPs可降解基质，但也可通过TIMP-2桥将MMP-2结合到细胞表面从而调节其活性。因此，细胞可以通过在侵袭前局限表面蛋白水解、黏附分子和GF受体，以协调方式对转移信号作出应答。

表5-2 参与肿瘤侵袭转移的主要蛋白酶

对人类和小鼠组织样本进行的全面分析表明，与正常组织或良性病变相比，恶性肿瘤中的u PA显著增加［14，15］。事实上，作为肿瘤细胞相关蛋白水解的主要调控因子之一， u PA在肿瘤细胞播散过程中起着核心作用［16，17］。由肿瘤细胞产生的u PA可激活一系列级联反应，先将纤溶酶原激活形成纤维蛋白溶酶，随后导致其他蛋白酶的活化和ECM的降解(表5-2，图5-25，图5-26)。在排卵、滋养细胞的浸润性生长、哺乳期后乳腺重塑、炎症反应、血管生成和神经系统发育等许多正常进程中，这些反应都是被高度调控的［18-23］。在肿瘤中，u PA的产生和酶级联的激活都被大大增强，导致ECM的降解，并创建侵袭阵线，使肿瘤细胞能够迁移和侵袭到其他组织和血管［24］(图5-25和5-26)。各学术及工业实验室都在积极研究这种降解ECM和促进侵袭的特殊能力，以设计特异性靶向疗法。所以，u PA的酶学特征已被较深入地研究。

图5-26 u PA的激活和调节

注: u PA前体经过酶解激活为u PA的过程，启动了纤溶酶原转化为纤溶酶的正反馈机制。这反过来可以将更多的u PA前体转化为活化的u PA。u PA前体也可以通过其内在的酶活性(粉色)进行自激活。这种正反馈可被两种内源性抑制剂PAI-1和PAI-2(黄色)所阻断。u PA激活过程中的下游效应，如MMP的激活，使ECM得以重塑。因此，细胞迁移、侵袭和增殖等过程在转移性肿瘤细胞(蓝色)中是优先的。第二个层次的调节在于内源性抑制剂对纤溶酶活性的抑制，这将阻断其下游目标的激活(灰色)。u PAR/u PA/PAI-1三元复合物的形成，诱导u PAR再循环和u PA/PAI-1在LPR-1依赖过程中的溶酶体降解(绿色)。

(2) u PA的酶学特征

纤溶酶原激活剂u PA和t PA属于丝氨酸蛋白酶家族。与这个家族中拥有多种底物的其他成员如胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶等相比，u PA和t PA表现出对底物特异性选择的高度限制。此外，与其他丝氨酸蛋白酶酶原不同， u PA拥有很高的单链活性，相当于该酶双链形式时活性的0.2%。这种单链活性足以诱导pro-u PA自活化为双链u PA的活性形式［25］(图5-27)。

图5-27 双链UPA结构

注: 在Lys158～159裂解后，u PA的两条链(A和B)被形成的二硫键(SH-HS)连接在一起。A链包含类EGF结构域和三环结构域，被称为氨基末端片段(ATF)，负责u PAR的结合。B链中的丝氨酸蛋白酶结构域负责u PA的酶活性。催化部位定位于一个有S1区域的凹陷处，这是与其他丝氨酸蛋白酶的共同特点;在这个区域内，His57-Asp102-Ser195决定底物特异性，由于在弹性环路中靠近催化部位S1β区域的存在，该特异性进一步增强。Lys309的一个点突变，这个弹性环路被认为是u PA酶活性的关键。

u PA前体是人类一种含有411个氨基酸的多结构域糖蛋白，分子量55000(在小鼠中为48000);其活性形式是由单链中心Lys158～159号位点经血纤维蛋白溶酶裂解或自催化形成(图5-27)。这导致A和B这两个较短的链在Cysl48～Cys279通过单个二硫键连接在一起。此外，组织蛋白酶B、激肽释放酶和hepsin［26，27］也可以切割u PA酶原，产生有活性的u PA。u PA的A链(24000，1～158号残基)与纤连蛋白、纤溶酶原、凝血酶原具有序列同源性。这条链在N末端也有一个与EGF同源的序列(10～43号残基)，其后是一个kringle结构域(50～132号残基)，它们共同组成氨基末端片段(ATF)(1～135号残基)。这个区域还包括受体结合结构域(223～229号残基)(图5-27)。B链(30000， 159～411号残基)含有丝氨酸蛋白酶催化位点，并与其他丝氨酸蛋白酶如凝血酶、血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶等的S1特异性区域的催化位点有同源性，都含有由His57、Asp102和Serl95组成的催化三联体［28-30］(图5-27)。在u PA的催化结构域内，位于u PA弹性回路(297～313号残基)内的赖氨酸300，对于其催化活性是必不可少的。这种弹性回路中的突变，更确切地说是脯氨酸309上的突变，将影响u PA的酶活性［25］。从总体上看，一种酶的底物特异性不仅由酶催化结构域与其底物的相互作用决定，也受酶表面的相互作用辅助位点的影响。在u PA中，临近u PA的S1特异性区域存在一个Slβ区域，可以作为打开和关闭后面区域通路的开关。这可增强u PA与底物的结合效力，促进纤溶酶原更高效地激活［25］。

(3) u PA抑制剂

u PA的活性受特异性抑制剂调节，该抑制剂可由分泌u PA的同一细胞或邻近细胞如成纤维细胞和血管内皮细胞产生［15］。这些纤维溶酶原激活剂抑制剂(PAI)被称为PAI-1和PAI-2［31］(图5-28)。它们是抑制u PA的抗蛋白水解酶，属于丝氨酸蛋白酶超家族。PAI-1是分子量为52000(含379个氨基酸残基)的单链糖蛋白，以1∶1的比例与u PA共价相互作用。PAI-2由同一m RNA编码的分子量为60000的循环糖蛋白和细胞内非糖基化结构组成，其表达模式的限制性比PAI-1还强。它主要在胎盘、单核细胞和表皮中被检测到，其功能虽然还没有被完全研究清楚，但已知它可以限制肿瘤浸润［32］。除了作为蛋白酶抑制剂，细胞内PAI-2还能在病毒感染时控制被感染细胞的病变和凋亡［33］。

图5-28 PAI-1对肿瘤细胞相互对立的作用

注:u PA与u PAR结合后，PAI-1在其催化部位结合u PAR和u PA，可抑制u PA的酶活性，减少ECM的重塑。除了抑制u PA的活性，高水平的PAI-1可以发挥相反的效应，如通过增强血管稳定性诱导血管新生，或阻断ECM组件玻连蛋白的结合，有利于细胞迁移。

正常细胞和肿瘤细胞中，u PA分泌的抑制主要由PAI-1控制。这种抑制剂以一种不可逆转的方式结合双链形式的u PA［34］。为了确保从细胞表面完全去除蛋白酶活性，蛋白水解处于非活跃状态的u PA-PAI复合物被内化。这种情况会在PAI结合到已结合u PA的u PAR上时出现。此三元复合物的内化与α2-巨球蛋白受体/低密度脂蛋白受体(LPR-1，即α2M/LDL-受体相关蛋白-1)有关联［35-37］。u PAR-u PA-PAI-1复合物以网格蛋白包被囊泡的方式内化。随后，u PA-PAI-1复合物被溶酶体降解，而u PAR和LRP-1通过内吞组件被回吞并循环至细胞表面［38］。肿瘤细胞通常缺乏这种精细调控。

从这个意义上说，与预计相反，PAI-1并不是侵袭和转移的抑制剂。事实上，肿瘤中高PAI-1水平与侵袭水平和血管生成的增加有关，PAI-1的过表达在许多类型的肿瘤中被认为是预后较差的标志［39］(图5-28)。增加PAI-1表达所得到的这种意想不到的结局，是其与u PA以外的其他分子相互作用的结果。PAI-1能够与ECM的组分玻连蛋白(vitronectin)相互作用，与u PAR和整合素(如αvβ3、αvβ5)竞争性地与中心黏着位点结合，从而诱导细胞脱落，并有利于细胞迁移［15，40，41］。最重要的是，当PAI-1被发现可能有利于肿瘤血管生成时，它的这种自相矛盾的作用可以被部分解释。PAI-1的高表达与血管生成增加有联系，而在肿瘤中缺氧的结果是诱导PAI-1的表达［42，43］。研究发现，PAI-1作用于血管内皮细胞能够稳定血管［44］。因此，PAI-1表达水平高的肿瘤有更多特有的血管，以最大限度地减少泄漏和更好地为肿瘤实质供氧(图5-28)［44-46］，这有利于肿瘤的生长和播散。总之，这些结果突出了u PA及其相关分子如PAI-1在确定肿瘤细胞行为方面的重要性，其促侵袭、促血管形成、增强运动性等作用都证明了这一点。在下面的章节中，我们将探讨u PA和u PAR的非蛋白裂解功能，以及以这个多功能细胞表面复合物为治疗靶标的新策略。

5.8.2 u PAR

(1) 肿瘤中u PAR的表达和蛋白水解支架作用

为了顺利通过组织障碍，肿瘤细胞需要参与动态改造ECM的可控水解反应。为了充分准备以完成这些反应，肿瘤细胞必须产生蛋白水解活性。细胞表面相关的蛋白酶可能是完成这一可控、集中水解反应的最佳选择，该反应发生在体内环境中的一个复合体内(图5-25)。

表面蛋白水解特异性定位的最典型例子是u PA系统，其中涉及u PA及其受体u PAR，以及血纤维蛋白溶酶。这一机制已被证明具有促进肿瘤细胞浸润和转移的作用［3，15］。3个与Ly6/CD59家族蛋白质具有相似性的同源结构域组成了u PAR，并通过GPI锚与质膜相连［14］(图5-25)。最近已确认这个家族的几种新成员，它们可能在肿瘤发展中起作用［47，48］。在细胞表面，u PA与u PAR的结合可将纤溶酶原转化为纤溶酶的效率增强40多倍，这个功能使肿瘤细胞得以通过障碍物进行运动［15］。此功能可通过u PAR在细胞表面上二聚体化或寡聚体化得到进一步增强［14］。此外，在非蛋白裂解功能中，u PAR被发现作为ECM分子玻连蛋白的受体，在调节正常细胞和肿瘤细胞的运动性上起重要作用［15，40，49］(图5-25)。

u PAR在肿瘤细胞中过度表达，其表面分子表达量可高于正常细胞100～500倍［50］。u PA也被发现存在类似的过表达现象［50］。事实上，u PA和u PAR的基因表达由类似的信号通路和启动子调控元件所控制，众多的癌基因和生长因子信号通路可诱发这些基因表达［50］。由于其对侵袭和播散的促进作用，u PA和u PAR可在一小部分原位肿瘤中被检测出来，但绝大部分都是出现在侵袭和转移病灶中［50］。u PA和u PAR在乳腺原位导管癌中的表达可预测疾病的早期复发［51］，表明这种蛋白酶及其受体的富集可能先于肿瘤细胞的播散。目前尚不清楚是否由于特定蛋白酶缺乏或若干关键蛋白酶未表达，导致了原位癌细胞局限于上皮区域内;也不清楚在这些情况下，是否出现未被发现的微浸润和早期传播［52，53］。

如上所述，结合u PAR的u PA激活纤溶酶原的转换效率远远高于可溶性u PA［15］，配体和受体的高度过表达放大了肿瘤细胞改造自身微环境的能力。纤溶酶反过来又可以直接或间接激活原胶原酶1(pro MMP-1) 和前基质溶素1 (pro MMP-3)，以及其他基质金属蛋白酶(MMP)，放大蛋白水解能力，并进一步促进ECM的降解［15］和细胞侵袭(表5-2，图5-25，图5-26)。临床数据支持u PA和u PAR表达与恶性表型富集的相关性，在乳腺癌中，这些蛋白质在原发肿瘤组织的高表达往往是预后不良的指标，并可用于疗法的选择［54，55］。例如，u PA和u PAR的表达与乳腺癌、结肠癌患者的无瘤生存时间缩短有关［54］。由此可见，这些蛋白酶的富集应该赋予细胞侵袭和播散到新的解剖部位的优势。

(2) u PAR是肿瘤细胞中强有力的信号转导剂

1990年尿激酶受体的克隆［15，56］开创了纤溶酶原激活剂研究领域的新时代，并使人们更好地认识了发生在正常或病理条件下，依赖u PA的纤溶酶原的活化效率、局部化情况和聚集情况［15］。然而，u PAR的一个完全意想不到的作用(稍后讨论)当时尚未被发现，即u PAR可以通过调节整合素功能，为具有强大运动能力和增殖能力的肿瘤细胞传播有丝分裂信号［57］。

在u PAR被发现10年之后，才发现u PAR与离散信号通路的激活以及这些信号对细胞运动的调节是联系在一起的［58］。作为一个GPI锚定分子，u PAR可在由脂筏组成的离散表面和含小窝蛋白(caveolin)的小窝结构中局部累积，这可能会进一步增强u PA/u PAR复合物的水解拓扑结构和信号转导能力［59］。然而，在小窝蛋白阴性的肿瘤细胞表面大量过表达的u PAR，表明其组织顺序包括适当的调控在肿瘤细胞中可能已经丢失［60］。目前已经明确，u PAR是一种具有三重功能的受体:它可以通过u PA在细胞表面聚集和局部化纤溶酶原的激活，也可作为玻连蛋白的非整合素受体，还能在cis位点影响整合素功能并启动细胞内信号转导。事实上，大多数高表达u PA和u PAR的人类肿瘤符合以下特点:阻断u PAR与u PA的结合，可以阻断肿瘤细胞的侵袭和转移［15］。在细胞培养中曾报道u PA对有丝分裂的影响， u PA结合到细胞能够激活已知的信号蛋白，如FAK、SRC、ERK、P38和MLCK等，这些蛋白都有助于细胞运动［3，57］。然而，u PAR信号通路对体内肿瘤细胞增殖所作贡献的重要性仍未得到解答。

临床证据表明，u PAR可调节增殖，并且可能是调控从增殖状态到静态/休眠行为的过渡，这个结论来自于对胃癌［61］和其他类型肿瘤患者骨髓肿瘤细胞的研究。在胃癌研究中，患者的骨髓样本取自手术前和其后每隔6个月。为了检测肿瘤细胞的存在，对样本进行抗细胞角蛋白和抗u PAR的双抗体染色。若患者骨髓的原始样品中含有u PAR阳性染色细胞，其后续样本中肿瘤细胞的数目是增加的。该结果是对患者较短期无瘤生存率的一个预测指标［61］。由于原发肿瘤已被切除，所得结论是:u PAR可促进转移到骨髓肿瘤细胞的增殖。

u PAR也可介导促生存信号的传播［62-66］。在脑瘤中，抑制u PAR的表达可引起颅内肿瘤细胞的大量凋亡［67］，这被证明是通过AKT途径实现的促生存信号转导功能。在同一类型的肿瘤中，u PAR可调节胶质母细胞瘤细胞局部浸润到周围正常组织中。因此，在这一类肿瘤中，u PAR的促生存功能与其蛋白水解功能是相互联系的［67］。

在一些研究中使用反义m RNA在鳞癌细胞(HEp3)中阻断u PAR的表达，从而获得了该受体在肿瘤中促有丝分裂作用的证据［68］(图5-29)。该实验导致一株人类鳞癌细胞系的恶性程度丧失［68］，这不仅表现在预料中的肿瘤细胞浸润性的大幅度降低，也表现在意料之外的致瘤性的完全丢失［68］。更深入的研究发现［69］，致瘤性的丧失与u PAR低表达细胞在体内形成小肿瘤结节的能力有关，该小结内包含活的处于休眠状态的肿瘤细胞，这与正常血管的存在无关［68，69］。这种休眠行为的特点是扩散的急剧减少，并可见于几种模型［68-75］。休眠行为在HEp3细胞中也被发现，该细胞可自发下调u PAR，与通过反义技术实现的效果类似［60］。虽然在肿瘤研究中取得了这些重大进展［76］，GPI锚定受体的信号传导机制目前仍不清楚。

图5-29 肿瘤生长中的u PAR-整合素信号传导

注: (左图)在高表达u PAR的细胞中，结合u PA的u PAR频繁地与整合素α5β1相互作用，使其激活，引起整合素依赖的FAK/EGFR复合物的招募，从而导致Ras-ERK信号通路的激活。随之，该复合物维持Cdc42的失活，阻止p38的激活，这导致有丝分裂ERK/p38信号比值升高。下调u PAR或阻断α5β1功能(右图)将导致整合素灭活、复合物分解，以及细胞内信号元件失活的结果，将降低ERK的活性。相反，Cdc42被激活并诱导p38激活。p38的激活会对ERK信号施加一个额外的负调控，这将导致ERK/p38比值降低，并诱导生长停滞，阻断FAK或EGFR活性也可诱导生长停滞，这与其对ERK活性很强的抑制作用有关。

(3) u PAR参与黏附和肿瘤细胞有丝分裂的生长因子信号通路

u PAR信号通路的阻断可诱导休眠并可作为一种治疗手段，这是促使我们对产生这种现象机制进行研究的动力［60，77，78］。由Chapman实验室进行的先驱工作［79］表明， u PAR能与整合素相互作用并调节其功能［59］。随后u PAR被证明参与纤连蛋白(FN)受体整合素α5β1的频繁相互作用［60］。这种相互作用在表达u PAR反义序列的人类肿瘤细胞或同一来源但自发下调u PAR的细胞中大大减少［60］。由于u PAR激活整合素功能，过表达u PAR的细胞可有效地与FN结合(图5-29)。近期对u PAR和整合素αMβ2相互作用的研究进一步证明，u PAR可与整合素相互作用并调节其活性构象［80］。在u PAR下调的细胞中，虽然整合素α5β1的总体水平没有改变，但它们的激活状态下降，且作为黏附受体的功能大大降低［60］。虽然在该系统以及其他系统里u PAR通过整合素依赖的方式转导信号，但也证明其可独立于整合素进行信号转导［49，81］。然而，GPI锚定受体在缺少适配器的情况下以何种方式转导信号，目前还不清楚。

随后，人们发现在HEp3鳞状细胞癌模型中，高表达u PAR的细胞内，u PA对ERK-MAPK信号通路(有丝分裂信号级联)的激活也较强［60］。相反，在u PAR下调的细胞中ERK只表现出轻微的活性。这直接依赖于整合素从固化的FN中有效地获得有丝分裂信号的能力，而u PAR下调的细胞无法“感觉”到FN并激活ERK［60］。

整合素可激活黏着斑激酶(FAK)［82］，该激酶在鳞状细胞癌中是超激活的［83］。研究发现，在u PAR下调的细胞中，其主要的自磷酸化酪氨酸(Y397)位点存在降低的FAK磷酸化现象，这是原先就存在的或与FN粘连后的反应［77］。由u PAR诱导的ERK活化和增殖，所需的FAK为显性负突变表达的FAK(称为FRNK)，它缺乏NH2和FAK中央激酶结构域，但仍可与整合素复合体相互作用［84，85］，强烈下调活化的Ras和ERK水平［77］。因此，FRNK的表达同样迫使这些高表达u PAR的人类肿瘤细胞进入静止期。总之，这些结果都表明，FAK在u PA/u PAR-α5β1信号到Ras-ERK模块的介导中是至关重要的［77］。

研究表明，FAK可以与整合素以及生长因子受体如EGFR或血小板来源生长因子受体相互作用［84，86-88］，这使得FAK可以作为连接整合素和生长因子信号通路的桥梁。进一步的研究表明，EGFR是u PA/u PAR/α5β1/FAK复合体连接u PAR信号与Ras-ERK通路所需的组分［78］。在u PAR下调的细胞中EGFR磷酸化急剧下调，而当细胞与FN结合时，只有高表达 u PAR 的细胞能够有效地激活 EGFR (图5-29)。此外，用sc-u PA(无蛋白水解活性)对细胞进行治疗可强烈激活EGFR-ERK通路，但仅对u PAR表达水平高的细胞有效［78］。过表达负性表皮生长因子受体FRNK，以干扰FAK和EGFR信号通路，或用抑制EGFR激酶的复合物(AG1478)进行治疗，都可解除EGFR和ERK的激活［78］。

因此，如图5-29所示，将u PAR信号转导到ERK通路所需的最小复合体(u PAR复合体)，将至少包含u PA、u PAR、α5β1FAK和EGFR［78］。这将导致在高u PAR水平与低u PAR水平的细胞间，活化的ERK水平相差可达4倍以上。这种差异可以明显地在体外检测到，最重要的是，在接种于体内的高u PAR和低u PAR细胞也可检测到［57，60，71，77，78，89，90］。因此，高表达u PAR的细胞能够形成逐渐增长的肿块，具有“构成”ERK的活性;而低表达u PAR的细胞丢失了这种能力，只能潜伏在体内［60］。

与前面所述u PAR对有丝分裂通路的调节一样，实验表明u PAR的阻滞将导致体内静止状态的出现［60，69，78］。在体内接种后的最短24小时内，表达高水平u PAR和活化ERK的细胞多数处于S期，这些休眠细胞表现出G0/G1期的阻滞状态，该状态在接种后的最短48小时内就已建立［60，69，78］。

5.8.3 靶向肿瘤细胞中的u PA和(或)u PAR

(1) u PA的小分子抑制剂及其治疗转移性肿瘤的潜在用途

从20多年前起，人们就知道使用特异性抗体灭活u PA，可以导致肿瘤细胞浸润或转移能力的降低。Ossowski和Reich开创性的实验研究［91，92］表明，用肿瘤源性u PA抗体进行治疗可延迟远处转移的出现，说明这一过程的早期阶段需要蛋白酶。直接的证据来自人类鳞状细胞癌HEp3的鸡胚尿囊膜模型，该模型使用兔抗体抑制人类u PA的催化活性，但没有抑制鸡u PA。当向胚胎静脉注射抗u PA抗体时，可有效抑制肺转移［91］。每天注射抗人u PA抗体，也能抑制裸鼠HEp3肿瘤的局部侵袭。然而，在这些异种移植模型中，对肿瘤侵袭的抑制并没有同时导致远处转移发生率的降低［93］。

阻滞u PA特别是细胞表面u PA的活性，引出了“发展抗侵袭药品”这样一个有吸引力的目标。设计对u PA有适当效力和选择性的低分子量合成酶抑制剂，为实现这一目标提供了有趣的方式。在实验中，早期用来抑制纤溶酶原激活的物质，包括已知的含有anecdotal或具有非特异性抗蛋白水解活性的化合物。已研究的有米诺环素、EDTA、邻二氮菲、E-氨基己酸和抑肽酶以及其他多种化合物［94，95］。令人遗憾的是，大多数能阻断u PA的化合物都会干扰t PA或血纤维蛋白溶酶。由于潜在的抑纤溶性，它们不适宜作为抗肿瘤侵袭药物使用。

1987年，有报道称保钾利尿剂阿米洛利为温和的u PA选择性抑制剂，且对t PA或纤维蛋白溶酶影响很小，甚至没有抑制作用［96］。后来，基于对阿米洛利的修饰，合成了更有效和高选择竞争性的u PA抑制剂［97，98］。该抑制剂含有多个单环和双环芳香胍类及脒类，其中编号B428和B623(4-取代苯并比噻吩-2-羧酸脒)的两种化合物，显示出可阻断游离和细胞表面u PA活性的能力，并能阻断HT-1080人纤维肉瘤细胞中u PA介导的纤连蛋白降解［97，98］。用B428或B623进行日常治疗可明显阻断高侵袭性同源鼠乳腺癌的局部侵袭，且无明显毒副作用。但是，该化合物既不能抑制肿瘤诱发的血管生成，也不能减少该临床前模型肺转移的发生率［99］。其他纤维蛋白溶解酶和纤溶酶原激活剂［100，101］也可能在u PA抑制方面起一定的作用。

阿米洛利或B428剂量的增加未能消除大鼠乳腺癌的肺转移，说明在转移扩散中这些化合物的抑制活性已达到上限［102］。Klinghofer等人［103］提出了物种特异性对以脒为基础的u PA竞争性抑制剂(如阿米洛利和B428)的重要性。他们在啮齿动物和人类中对多种u PA抑制剂进行了酶活性检测，并作了比较研究，报道了物种之间的相关差异。因此，在设计和进行体内u PA抑制剂的研究时应谨慎观察，尤其是当小鼠和人类的u PA/u PAR系统组件都有表达的时候，例如移植瘤模型中［103］。

不过，B428与抗雌激素的他莫昔芬［104］或钙通道阻滞剂维拉帕米［105］的联合能有效地阻止乳腺癌在不同啮齿类动物模型中的转移扩散。同样，阿米洛利与cox-2抑制剂塞来昔布共同给药，在老鼠乳腺癌模型中可减少局部复发并抑制转移，这强调了联合辅助治疗的效用［102，106］。

使用高剂量最强效u PA拮抗剂甲脒B623部分抑制血管内纤维蛋白溶解，可提高肺癌血源性转移细胞的定植能力［99］。B623在血浆存在的情况下可诱导纤维蛋白沉积以及随后的肿瘤细胞聚集，并可能通过这一机制促进转移［99］。据此，一些研究者推测，注射纤维蛋白溶解激活剂如u PA，可能溶解循环中癌栓归巢所需的肿瘤-细胞相关纤维蛋白［107］。这些研究强调了在调节肿瘤蛋白水解与宿主蛋白水解时需要达到的至关重要的平衡。

在此背景下，u PA抑制肿瘤进展的作用可能取决于两个对立活动之间的颇为微妙的平衡。如果u PA增加原发瘤细胞的脱落，对它的抑制可能会阻止肿瘤的侵袭。反之，如果循环纤溶酶原的激活干扰了靶器官血管中肿瘤细胞的捕获和递交，u PA的抑制将抵消这种影响，从而导致转移性定植的增加。该观点与“某些蛋白酶抑制剂可同时促进及抑制转移”的假设是一致的［39］。绝大多数的肿瘤在诊断时就已发生播散的事实也许可以解释这些刚好相反的效果［53，108］。即使在小的“无侵袭”病变，如乳腺导管原位癌(DCIS)中也能观察到播散［53，108］。因此，如果在原发肿瘤已被去除之后，以u PA为靶标来重点限制残余细胞的扩散和局部浸润，但对循环肿瘤细胞可能没有影响。

最近，Joossens等报道了对一系列非肽类小二芳基膦酸酯酶抑制剂的研究进展［109］。其中有些抑制剂通过纳摩尔活性表现出对u PA高度选择且不可逆转的抑制作用。对选定化合物的初步研究表明，其在大鼠乳腺癌模型中有显著的抗转移效果，且无急性毒性作用。作者表示，选择性且不可逆的抑制u PA在癌症治疗中是有价值的［109］。其他针对u PA的小分子或肽衍生物包括不同类别的精氨酸类似物，如脒基苯丙氨酸(amidino phenylalanine)、脒基苯甲胺(amidino-benzylamine)和4-arylguanidine抑制剂［110］。有些化合物正在进行深入的临床研究，以努力为癌症患者开发出抗转移的预防性药物。候选化合物需与现有的抗肿瘤疗法相结合，在高转移风险的有疑似残余病灶的患者中进行检测。这是非常重要的，因为这些疗法的成功与否极有可能取决于肿瘤的压力。在切除肿瘤后，针对残留病灶中的u PA蛋白水解系统，可能提供限制肿瘤继发生长的机会。

(2) 靶向u PA-u PAR连接可阻断u PA-u PAR复合体的蛋白水解和信号转导功能

以u PA-u PAR复合体的信号转导属性为靶标设计的新治疗策略，可能是治疗微小转移性残余病灶的另一个有效的方法。受体将u PA依赖的蛋白水解酶活性定位在细胞表面，并通过整合素的调节功能进一步传播肿瘤细胞的运动和增殖信号［57］。有趣的是，抗酶促化合物B428不仅能抑制肿瘤相关的蛋白水解，也可干扰肿瘤细胞的黏附和迁移，这表明该化合物可能改变了u PAR动员和u PA依赖的细胞信号转导［111］。这些初步结果强调，u PA及其受体参与附着、水解和迁移，且肿瘤侵袭的这3个进程可以由合成的u PA抑制剂阻断。

不同研究小组都描述了对u PA-u PAR相互作用中线性肽拮抗剂的研究进展［112，113］。在鸡胚培养的人类HEp3癌细胞中，某些该肽类化合物可竞争性抑制乳腺癌细胞上结合的人类u PA，并阻断血管内渗［114，115］。新型环肽拮抗剂也被发现，在裸鼠体内表现出对人卵巢癌细胞生长和扩散的抑制［116］。此外，一些小分子u PAR拮抗剂也有报道，包括N替代的肽衍生物、低聚噻吩、基于联苯的多肽模拟物和羟基苯并二氢呋喃-3-酮衍生物，其中的某些化合物存在纳摩尔活性［110］。

(3) 靶向u PAR的顺式相互作用可阻断肿瘤有丝分裂信号

u PA-u PAR复合物对有丝分裂的信号转导功能存在另一种可能性［57］。最近证明，通过u PAR第三结构域上第240～248个氨基酸残基组成的区域，该受体可与整合素相互作用并调节其信号［117］。另一项独立的研究也发现，该区域对调节u PAR和整合素之间的横向互动是十分重要的［118］。尤其是，丝氨酸-245、组氨酸-249被发现为此功能的关键点，因为这些残基的Ala突变将造成整合素激活功能的缺失［117，118］。这个信号被证明对肿瘤的生长是重要的，因为丝氨酸-245位点上突变的u PAR不能在体内有效激活ERK信号和激发体内肿瘤生长［117］。

对近期确定的u PAR立体结构的分析表明，丝氨酸-245位于u PA与u PAR相互作用面的相对面。这进一步支持了先前的研究结果，即包含该区域的肽类抑制剂或受体突变体本身对u PA与该受体的结合没有影响［117］。因此对以该区域为标靶的小分子抑制剂可能进行筛选，这些抑制剂可同时干扰u PAR与整合素的相互作用及其有丝分裂激活功能(Ossowski等，私人交流)。这些研究还显示u PA与u PAR以及u PAR与整合素结合具有高度特异性靶向的可能性。而且还发现u PAR第二结构域中的一个区域对细胞外玻连蛋白的结合非常重要，该区域对u PA的结合能力没有影响，对运动性有很强的抑制作用［41，119］。因此，可能只有结合运用这些策略，才能将u PAR的功能完全消除。由于激活有丝分裂和运动需要u PA与其受体相结合，这些抑制性的策略可能会有协同作用。正如前面所提到的，由于u PA和u PAR在绝大多数实体瘤中的过度表达，这些u PA-u PAR结合疗法可能对病人非常有益。

5.8.4 结论及未来方向

这里总结的数据显示了自从20世纪70年代初首次描述纤溶酶原激活因子以及1990年首次描述u PAR以来，已取得的令人振奋的进展［7，56］。这些研究强调了在肿瘤发展中u PA和u PAR的巨大生物学作用，以及它们详细的分子和细胞结构，这些研究已经以u PA-u PAR复合体3个方面的功能即蛋白水解、运动性、生存/有丝分裂为靶标制订治疗策略。u PAR基因敲除小鼠不易产生严重发育缺陷的事实［120］，表明这些策略可能只针对特定的肿瘤细胞，且副作用少。

这些新的治疗性分子的成功应用，不仅取决于这些抑制剂的药效，也取决于治疗方式的改变。与大多数抗癌策略一样，确定这些靶向治疗方式针对残余病灶的疗效是否优于将其用于肿瘤去除的疗效将是非常重要的。由于扩散的肿瘤细胞一直都是局部复发和转移的根源，在残余病灶中以u PA-u PAR复合体为靶标可能是更为理性的战略。

(魏金旺译，钦伦秀审校)

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