肿瘤转移的路径

◎Tara Karnezis，Ramin Shayan，Marc G. Achen，Steven A. Stacker

血管和淋巴系统是气体、液体、营养成分、信号分子，以及组织和器官之间细胞运输的必要通道。这两个高度分枝、树型网络通过胸导管互相连接，胸导管是最大的淋巴管，将富含蛋白质的组织间液即淋巴液引流入血液循环。这两个网络在健康人维持动态平衡，它们的畸变或功能障碍将导致肿瘤等多种疾病的发生［1］。

肿瘤的致死性主要与转移有关，即肿瘤细胞从原发位点向淋巴结和远处器官的扩散［2］。一般肿瘤细胞在体内的扩散主要通过3个途径:直接侵犯周围组织、通过血液系统传播到远处器官(血行扩散)，或通过淋巴系统到达前哨淋巴结、远处淋巴结以及远处器官(淋巴扩散) (图5-30)。

图5-30 转移的潜在路径示意图

注: 肿瘤细胞可通过淋巴管(黄色)或血管(红色)进行扩散。

肿瘤细胞诱导肿瘤内以及肿瘤和引流淋巴结周围的新淋巴管生长，促进免疫细胞向淋巴结运输。肿瘤内淋巴管密度升高也与淋巴结转移的增加有关［3］。淋巴结转移范围是疾病分期的主要决定因素。虽然淋巴转移具有重要的临床意义，但对肿瘤淋巴系统扩散的调控机制还知之甚少。以前认为肿瘤细胞通过淋巴管进入淋巴结是一个被动过程，由于淋巴管壁薄，且缺乏物理基膜屏障等特征使其易于摄取肿瘤细胞。由于缺乏区分血管和淋巴管的分子标记，以及没有确定的促淋巴管生长因子，对淋巴系统在肿瘤扩散方面的研究遇到阻碍。然而最近一段时间，由于区分淋巴管与血管的特定分子标记和促淋巴管生长因子——VEGF-C和VEGF-D的确定，以及利用这些工具所建立的动物模型，都表明淋巴管生成与肿瘤转移途径有关，并可能是一种主动过程［4-7］。对淋巴系统的研究有引人注目的前景，不仅因为其在生物学方面的意义，也因为了解淋巴管生成的分子调控可以为设计防治淋巴转移的抗癌疗法提供靶点。

5.9.1 肿瘤淋巴系统研究的历史概况

对淋巴系统的第一个描述可以追溯到古希腊，那里的医生在解剖人和山羊胃肠系统时发现了淋巴管。希波克拉底曾将淋巴液称为“乳色血液”［8，9］。17世纪发现淋巴从身体的各个区域引流，同时也认识到，这些淋巴途径作为一个有组织的系统合并到胸导管，并从那里进入中央静脉系统［10］。淋巴进入淋巴系统的途径，部分是由Hunter提出的(1746 年)，他观察到毛细淋巴管参与到吸收活动。Recklinghausen(1862年)相对毛细血管床中的动静脉血液“循环”特点，建立了“盲端”淋巴管的概念［10］。更远久的200年前，Sabin通过猪胚胎注射研究发现淋巴系统是由静脉起源的［11］。我们认为，定义原发肿瘤的性质，将其与转移灶区分是非常重要的。

16世纪首次关注到淋巴系统在肿瘤细胞扩散中的重要性，当时观察到，伴腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者生存期明确差于局限性原发瘤的病人［12］。在20世纪中期到后期采用了注射放射性淋巴造影剂和不透射线染料的方法进行淋巴放射成像技术，可以用来研究活体中的淋巴管［13］。这种方法为现代淋巴造影技术和前哨淋巴结活检奠定了基础，后述还有详细的讨论。

有关肿瘤淋巴管的第二个主要临床进展是临床医生开始使用放射性同位素注射，以更好地了解哪些淋巴结群引流身体的不同部位［14］，这些重要信息可以确定肿瘤通过淋巴管道转移的潜在路线。20世纪后期出现了淋巴管走向图，可用于对每一个患者特异性肿瘤的淋巴引流进行预测，并识别前哨淋巴结［15］。

5.9.2 淋巴系统的结构特点

淋巴系统薄壁脉管复杂网络的构建是从皮肤表面的真皮层开始的，由于其具有高渗透性、盲端囊状结构而被称为吸收淋巴管或毛细淋巴管(图5-31)［16，17］。不同于毛细血管，这些淋巴管由单个薄且无孔的淋巴管内皮细胞(LEC)构成，并不覆有周细胞或平滑肌细胞(SMC)。在毛细淋巴管中LEC之间特征性的重叠细胞连接起阀门的作用。间隙中增加的流体压力通过锚定丝产生牵引力，导致这些连接打开，从而进行液体吸收。在周围的细胞外基质液体量减少后，锚定丝放松，让LEC返回静息时的重叠状态［18］。其他液体吸收的方法包括通过LEC自身的细胞内运输，这一过程被称为胞饮［19］。近日，已发现初始淋巴管内皮细胞之间的新连接，从而增加了一种液体吸收的方法;这些不连续的扣状连接(“纽扣”)与在吸收淋巴管或血管中发现的一般连续细胞连接(“拉链”)不同，是在不破坏交界完整性的前提下，可以打开和关闭并能促进液体吸收的专门化连接［20］。

图5-31 真皮和皮下组织发现的淋巴管亚型的分子特征和示意图

注: 举例展示了可能用来识别淋巴管亚型的分子标记，但不是所有表示淋巴管的分子标记都被标出。

毛细淋巴管汇集到位于真皮层深处的预收集淋巴管中，这些管道是淋巴引流的起始路径(图5-31)。这些预收集淋巴管由包含阀门的片段组成，且被基膜和平滑肌细胞环绕。这些片段中穿插着与起始毛细淋巴管形态相似的区域［21］。预收集管道可能主要在淋巴推进中起作用，而不是吸收淋巴液，吸收工作是由起始的毛细淋巴管完成。接下来，预收集淋巴管引流到位于皮下组织的收集淋巴管。这些收集淋巴管具有环状平滑肌细胞，以及由平滑肌细胞和周细胞组成的规律的管腔内阀门［17］，且一般直径超过200μm。收集淋巴管汇入淋巴干，然后进入胸导管。在肿瘤扩散的过程中，这些淋巴管因对肿瘤源性VEGF-C的应答而扩张，从而增加淋巴流动和将肿瘤细胞运输到淋巴结的能力，这些肿瘤细胞可能在淋巴结被捕获并增殖，或进一步扩散到远处器官［22，23］。

5.9.3 淋巴系统的发展

动物模型是研究淋巴系统发展的宝贵工具。Florence Sabin开创性的猪胚胎注射实验产生了淋巴系统通过“离心式发芽”(centrifugal sprouting)发展的理论［11］。基于猪胚胎墨水注射实验，她推测两个颈淋巴囊是由前主静脉内皮萌芽发展而来的。由于哺乳动物的淋巴系统起源于静脉，其形态发生包括获得LEC的标记以及从血管系统分离，分离通常通过获得LEC特异性标记来实现(稍后讨论)。

在胚胎内早期动脉和静脉形成之后，最初的淋巴管主要由血管发展而来［24］。在小鼠实验中，这些LEC从主静脉中萌芽形成初级颈淋巴囊。在主静脉背侧一群特殊的内皮细胞(EC)中，Sox转录因子家族的成员之一Sox18触发另一个转录因子Prox-1的表达。Prox-1在淋巴管的发展中至关重要，通过上调淋巴特异性基因决定淋巴管的命运，同时抑制某些血管标记的表达［25，26］。这些Prox-1阳性内皮细胞还表达低水平的酪氨酸激酶受体VEGFR-3，这是能结合促淋巴管生长因子VEGF-C和VEGF-D的细胞表面受体。通过VEGFR-3的活化，Prox-1阳性细胞向着局部VEGF-C浓度梯度迁移，从而导致主静脉上这些受限的EC开始萌芽，形成原始淋巴囊［27］。淋巴囊以离心方式发芽形成原始的淋巴丛。在15.5个胚胎日(E)后，真皮丛形成并继续发展至产生预收集淋巴管的真皮层，从中萌生出原始的表皮毛细淋巴管丛［24，26，28］。

最近特异性控制淋巴管形成和发展基因的发现以及新淋巴管内皮细胞特异性标记的识别，促进了有关淋巴管生成分子调控机制的关键发现并提供了新的见解［26，29-32］。这些发现包括:在某些与淋巴功能障碍相关的遗传性疾病中识别了特定的基因缺陷，获得了恶性肿瘤可以直接激活淋巴管生成和促进淋巴转移的证据［33-36］。

5.9.4 淋巴管的分子标记

以往在组织学很难区分淋巴和血液脉管系统。需要可明确区分血管和淋巴管的标记。在血管和淋巴管中具有不同表达谱的几个分子标记的识别促进了对淋巴管的发展及其病理作用的深入研究。

血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1/CD31)是分子量130000的免疫球蛋白超家族成员［37］，被认为是一种泛内皮细胞标记，广泛表达于血管和淋巴管。它已被与基膜标记层粘连蛋白和IV型胶原联合使用;PECAM-1阳性，但基膜染色阴性且内腔中缺乏红细胞的脉管被确定为淋巴管［31，38，39］。此外，PECAM-1和PAL-E双染色已被用于识别淋巴管内皮［40］。肿瘤血管和淋巴结中高内皮微静脉特别表现PAL-E阳性，而毛细淋巴管内皮细胞则阴性［41］。淋巴管内皮特异性表达分子的发现，使淋巴管的识别能够更准确和简化。目前推荐的淋巴管标记主要有VEGFR-3(也称为Flt4)，是一种可结合促淋巴管生长因子VEGF-C和VEGF-D的细胞表面酪氨酸激酶受体［42-44］;平足蛋白(podoplanin)，一种在人工培养的人淋巴管内皮细胞上表达的完整膜蛋白，它是表达量最高的淋巴特异性基因［45-50］;LYVE-1，是CD44透明质酸受体的同源物，它是细胞外基质黏多糖透明质酸(HA)的淋巴受体［51，52］。图5-32显示了一些区别淋巴管与血管所使用的标记。其他推荐的淋巴管标记包括Prox-1、桥粒斑蛋白(desmoplakin)、人类β趋化因子受体D6、CCL21、CLEAVER-1和巨噬细胞甘露糖受体［53］。

5.9.5 淋巴管内皮细胞的特征

(1) 淋巴管内皮细胞的培养和纯化

历史上，纯化的LEC培养是由Johnston和Walker在20世纪80年代中期首次建立的，来源于从牛肠系膜中收集的淋巴管［54］。从那以来已培养出来包括人类、大鼠和小鼠不同物种的淋巴管内皮［55］。这些研究大多使用简单的机械方法从大淋巴管上分离LEC，由于这些脉管有丰富的营养血管网络，依然存在分离的细胞株纯度问题［56］。

将淋巴管内皮细胞区别于血管内皮细胞的淋巴管特异性标记的识别，是研究人员纯化同质性LEC的关键。这些差异的发现使技术不断发展，微真皮混合细胞中的LEC已通过平足蛋白、VEGFR-3和LYVE-1抗体进行阳性选择而分离，或通过血管内皮细胞(BEC)标记CD34抗体进行阴性选择［46，47，57，58］。纯化的LEC呈单层生长，具有独特的“鹅卵石形态”，表现出特征性的淋巴管样重叠细胞连接［17］。

这些研究表明，LEC和BEC在培养中会保持不同的表型。两种内皮细胞类型都有增殖性，并稳定表达已知的内皮细胞标记，如E-钙黏蛋白、CD31和von Willenbrand因子。LEC在体内选择性表达的分子——平足蛋白、LYVE-1、VEGFR-3在扩增的LEC中高表达，但在BEC中不表达，且这两种类型的内皮细胞在体外通过严格同型的方式构成有管腔的脉管［47］。这些研究结果表明，LEC和BEC可被纯化至相对同质化，构成稳定且特异性内皮细胞谱系，都伴随引导白细胞可能也包括肿瘤细胞进出组织的潜能。

图5-32 用来区分血管与淋巴管的标记

注: 上图:小鼠耳全标本包埋染色，PECAM(绿色)表示血管，LYVE-1(红色)表示淋巴管。下图:鼠真皮平足蛋白抗体染色，箭头为淋巴管。

然而，由不同的方法建立的LEC基因表达有一定差异［56］。这些差异可能由于源组织的不同(如成人与新生儿皮肤)或培养条件的差异;另外，不同的分离方式可能会选择出特定的LEC亚群。例如，通过VEGFR-3选择分离的LEC可能包含部分BEC，因为在不同的病理状态下血管内皮也可表达VEGFR-3［59］。在体外何种纯化方式和培养条件能够最好地保持淋巴管内皮细胞表型仍有待确定。最近，人们发现人工培养的内皮细胞的基因表达谱与从体内分离的细胞相比存在一定差异［60，61］。尽管如此，这并不影响人工培养的内皮细胞的使用，因为通过体内分离的方法获得的细胞数量非常有限，利用它们完成一系列实验在技术上具有挑战性。

(2) 正常和肿瘤相关内皮细胞的基因表达谱

从BEC中纯化LEC使我们能够研究正常和病变状态下的基因表达谱［61，62］。在正常状态下，LEC的分子标签似乎反映了其独特的功能特点，为了解淋巴功能的分子基础提供了新的视角［45，46，62］。研究发现，与BEC相比，LEC中蛋白质代谢、排列和运输相关基因显著上调［62］。特别是具有较高代表性的基因是那些编码控制膜囊泡靶向和融合特异性的蛋白质，如SNARE家族成员、rab GTP酶、AAAATP酶和sec相关蛋白，表明细胞中存在一个强大的膜囊泡运输系统。在电子显微镜下常可观察到，淋巴管内皮具有大量膜内陷和细胞质囊泡的特征，但尚未确定其功能意义［19］。

细胞间隙被认为是液体和蛋白质进入淋巴管的主要途径。从这些表达谱研究中获得的数据表明，除了细胞间运输，跨内皮途径也可作为分子进入淋巴管的机制之一，提示淋巴管有能力选择性地从间质中去除分子，从而主动控制体内淋巴液和组织间液组成的可能性［62］。LEC和BEC之间基因表达的其他差异包括编码炎性细胞因子和趋化因子的基因，以及与细胞骨架重塑和细胞-基质相互作用有关的基因，反映了两种类型细胞间肌动蛋白骨架在组织方面的差异［45］。

为了深入研究血行和淋巴转移的过程，对从肿瘤中分离的内皮细胞进行了大规模的表达谱分析，以确定肿瘤内皮细胞中差异表达的基因。在肿瘤血管形成的情况下，使用特异性标记对各种肿瘤来源的内皮细胞进行纯化，然后与正常的内皮细胞进行比较［63］。结果发现，正常血管内皮细胞和肿瘤血管内皮细胞高度相关，都表达许多内皮细胞特异性标记。在170多个显著表达的转录本中，有79个差异表达，其中包括46个在肿瘤相关血管内皮中特异性升高的标记。这些基因中的某些可编码细胞外基质蛋白，但多数还不清楚其功能。这些肿瘤血管内皮标记中的大多数在肿瘤中广泛表达，也在伤口愈合和黄体形成相关的正常血管中表达［63］。

同样，淋巴管侵袭是原发肿瘤向前哨淋巴结转移的关键步骤。为了进一步了解这个过程，对从正常组织和高转移性肿瘤脉管系统中分离的肿瘤LEC的RNA表达谱进行比较。发现许多差异表达的基因所编码的是内皮细胞连接组件、内皮下基质以及血管的生长和排列［64］。肿瘤LEC的表达谱有别于正常的LEC，其特征为某些具有重要功能的分子表达升高，如紧密连接调节蛋白内皮特异性黏附分子(ESAM)、转化生长因子-β辅助受体内皮糖蛋白(endoglin) (CD105)、血管生成相关的瘦素受体、免疫抑制受体CD200;以及某些内皮下基质蛋白表达的降低，包括胶原蛋白、原纤蛋白(fibrilin)和双糖链蛋白多糖(biglycan)［64］。因此，从肿瘤和正常血管中纯化的血管和淋巴管内皮细胞的基因表达谱在分子水平上是不同的，这一发现可能对抗血管生成和抗淋巴管生成疗法的发展有重要意义。

5.9.6 肿瘤淋巴管生成的分子调控

在发育和疾病中，VEGF均是血管和淋巴血管形成的关键调节因子。VEGF家族的成员是分泌性二聚体糖蛋白。在哺乳动物中，目前已经确定5个VEGF配体［(VEGF-A、B、C、D和胎盘生长因子(Pl GF))］，以及存在于副痘病毒(VEGF-E)和蛇毒(VEGF-F)中的结构相关蛋白质。这些VEGF以重叠模式与3个受体酪氨酸激酶结合，从而介导其作用。这3个受体酪氨酸激酶是VEGFR-1、2、3(图5-33)。

结构上，VEGF在保守位置上通过链内和链间的二硫键连接8个半胱氨酸残基，并形成同源二聚体。VEGF-A、VEGF-B和Pl GF的晶体结构已被解出［65-67］。VEGF家族成员的生物活性似乎是通过蛋白水解过程进行调节的，可与不同类型的受体发生特异性相互作用［68］。VEGFR属于酪氨酸激酶受体超家族，包含一个约750个氨基酸残基、进行7次免疫球蛋白样折叠的胞外结构域，另外还有一个单次跨膜区、一个并列膜结构域、一个酪氨酸激酶结构域以及一个C末端(图5-33)。通过与受体的结合，VEGFR能够形成同源和异源二聚体，这些二聚体随着受体酪氨酸激酶的激活，导致受体的自磷酸化;磷酸化的受体随后招募相互作用的蛋白质并诱导特异性的信号级联［68］。

VEGF-C和VEGF-D已被确认为淋巴管生成因子，通过LEC上表达的VEGFR-3发挥作用［69］。缺乏VEGF-C的小鼠不能形成有功能的淋巴系统，而转基因表达可溶性VEGFR-3会造成淋巴明显水肿的结果［27，48］。在动物肿瘤模型中，VEGF-C和VEGF-D可增加肿瘤相关淋巴管生成及淋巴转移［34-36］，VEGF-C和(或)VEGF-D的表达水平已被证明与许多类型人类肿瘤的转移有关联［70］。我们对淋巴管形成和生长的理解，大部分是源自促淋巴血管生长分子的发现;VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3信号轴被认为在发育和疾病中对淋巴管生成发挥了举足轻重的作用。

5.9.7 VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3信号轴

(1) VEGF-C

第一个被发现的促淋巴管生长因子是VEGF-C［71，72］。VEGF-C的表达不被缺氧调节，但会在促炎性细胞因子存在时增加［73-75］。VEGF-C是作为进行后续蛋白水解过程的前蛋白而合成的。VEGF-C的成熟形式由中央VEGF同源结构域(VHD)二聚体组成，并包含VEGFR-2和VEGFR-3结合位点(图5-33)［4，76］。未处理的VEGF-C与VEGFR-3结合，经过逐步水解处理的VEGF-C产生几种形式，对VEGFR-2和VEGFR-3的亲和力依次增加［4］。由于VEGFR-2可以在内皮细胞中广泛表达，VEGF-C可以在一定范围的组织内表达，VEGF-C作为前蛋白的合成可能阻止由VEGFR-2诱导的不必要的血管生成，并通过VEGFR-3让VEGF-C得到优先信号传导，这一作用在发育后期和成年阶段被限制在血管内皮细胞中［17］。在某些情况下，蛋白水解过程会释放成熟的VEGF-C，它通过VEGFR-3和VEGFR-2传导信号，促进血管和淋巴管生成［73］。

VEGF-C缺陷的小鼠缺乏淋巴管，造成组织液积聚从而在产前死亡［27］。在这些动物中，内皮细胞具有淋巴管谱系，但无法发芽形成淋巴管。这些突变体发芽功能的缺失可通过VEGF-C或VEGF-D而不是VEGF-A补救，表明VEGFR-3的特异性［27］。最近发现的爪蟾蝌蚪淋巴系统以及发育中的斑马鱼提供了研究淋巴管的更多模型［77-79］。利用斑马鱼模型，研究人员发现，与哺乳动物不同，其他物种通过VEGF-C/VEGFR-3轴介导淋巴管的发展［80］。

图5-33 VEGFs及其受体的结构和相互作用

注: (A)VEGFs是分泌型同型二聚体蛋白质，包含一个疏水性氨基酸末端分泌信号序列(sig)。所有成员都包含一个称为VEGF同源结构域(VHD)的中间区域。VEGF-C和VEGF-D是与淋巴管形成有联系的两个成员;VEGF-A作为比较对象。VEGF-C和-D的受体分别是VEGFR-2和VEGFR-3。这些受体的结构相关，由含有7个免疫球蛋白样结构域(Ig)的胞外结构域、跨膜结构域(TM)、含有激酶插入序列(KI)的分裂酪氨酸激酶(TK)结构域和羧基端的胞质尾(CT)组成。(B)VEGFs可与3种受体即VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3相结合。VEGF-C和VEGF-D的成熟和全长形式分别由“m”和“f”表示。VEGFR信号通路由不同的辅助受体，如神经纤毛蛋白(neuropilin)调节。结合配体后发挥的功能已在图中列出。

实验证明，VEGF-C促进内皮细胞迁移，并能诱导血管通透性和内皮细胞增殖。在血管中，这些生物效应被认为主要由VEGFR-2信号介导，尽管在BEC中VEGFR-3可上调表达并促进血管生成［81］。VEGF-C的促淋巴管生成效应被认为主要是通过VEGFR-3信号介导的，尽管VEGFR-2可在LEC上低水平地表达，并在淋巴管生成中发挥作用［4，82］。由于在血管中经过完全处理形式的VEGF-C可激活VEGFR-2， VEGF-C可同时调节生理和病理的血管生成，这些现象与在小鼠角膜和肢体缺血中观察到的一致［83，84］。此外VEGF-C还可以在多种模型中诱导淋巴管生成［75，85］，在皮肤中过表达时可促进淋巴管肿大［72］，并被证明可促进剂量依赖性静脉和收集淋巴管的扩张和迂曲，这些脉管都被证明可表达VEGFR-2［86］。

(2) VEGF-D

第二个被发现的促淋巴管生长因子是VEGF-D，一开始它被命名为“c-fos基因诱导生长因子”［5］。VEGF-D的成熟形式包含二聚体和中央VHD，经鉴定其与VEGF-C有61%的氨基酸序列相同［87］。VEGF-D可在VEGF同源结构域的N或C末端区域进行蛋白水解剪切。对VEGF-D的加工需要其产生能以高亲和力结合VEGFR-2和VEGFR-3的生长因子［88］。负责加工的酶包括前蛋白转换酶(PC)家族和丝氨酸蛋白酶、血纤维蛋白溶酶，已证明其能在体外剪切人类VEGF-D的N和C末端前肽段［89，90］。VEGF-C和VEGF-D促进肿瘤生长的能力，在蛋白水解剪切位点被去除时受到抑制，表明这些蛋白质的处理对它们发挥生物效应是重要的［91，92］(Harris和Achen，未发表)。

有趣的是，在小鼠中，VEGF-D只与VEGFR-3结合，提示VEGF-D可能在小鼠和人类中有不同的功能［93］。与VEGF-C不同，VEGF-D在小鼠淋巴管发展中的具体作用尚未得到证实［27，94］。然而，在爪蟾蝌蚪中，已表明VEGF-D可能在淋巴管形成中起“修饰者”的作用，尤其是LEC的迁移［95］。这些结果还没有在哺乳动物中进行验证，但高等脊椎动物中控制淋巴系统发育的机制似乎显示了高度保守性［96］。

病毒介导的人类VEGF-D成熟形式的传递诱导大鼠肌肉主要血管的生成，在皮肤中能同时诱导血管和淋巴管生成，这表明VEGF-D的生物学效应可能依赖于在特定组织中表达VEGF-D受体的血管和淋巴管密度［97］。成熟形式的VEGF-D在兔肌肉中可同时促进血管和淋巴管生成，而全长形式在这个模型系统中则特异性促进淋巴管生成，表明在不同的临床情况下VEGF-D的不同处理形式，可以产生明显不同的生物学效应［98］。更重要的是，在小鼠肿瘤模型中， VEGF-D被发现可以促进淋巴管生成和通过淋巴管的转移扩散［36］。在人类乳腺癌样本中，VEGF-D蛋白阳性的肿瘤血管也呈VEGFR-2和(或)VEGFR-3阳性，但呈VEGF-D m RNA阴性，这表明肿瘤细胞分泌的VEGF-D随后通过VEGFR-2和(或)VEGFR-3介导的吸收与内皮细胞联系，进而通过旁分泌机制促进肿瘤血管生成、淋巴管生成和转移扩散［99］。

(3) VEGFR-3

VEGFR-3是一种分子量约180000的高度糖化细胞表面受体酪氨酸激酶。其c DNA是从人类红白血病细胞和胎盘库中克隆而来［100］。已发现VEGFR-3的两种选择性剪接异构体，它们的胞质结构域长度不同，信号属性可能也存在不同［101］。基因敲除分析表明，VEGFR-3与淋巴管的形成和维持有关。

VEGFR-3与经蛋白水解处理的VEGF-C结合反应后，和VEGFR-2形成同源或异源二聚体［102］。更重要的是，与何种化合物形成二聚体指示其潜在磷酸化位点的使用，这可能反映了激酶不同的底物特异性［68］。VEGFR-3也被证明可介导在胚胎发育和肿瘤血管生成中有重要意义的特定通路的激活［48］。此外，VEGFR-3的信号转导也受辅助受体如神经纤毛蛋白-2(neuropilin-2)等的调节。这种相互作用的重要性已在神经毡蛋白-2-/-表型小鼠中得到证明，该模型未能形成正常的淋巴管和毛细血管［103］。

在一些常见的人类肿瘤中，VEGFR-3的表达与淋巴转移相关。例如，据报道，在子宫内膜癌中 VEGF-D 和VEGFR-3的存在可能是淋巴结扩散的预后指标［104］。人类前列腺癌中LEC上VEGFR-3的表达也被认为在肿瘤细胞转移扩散到淋巴结中有重要作用［105］。

血管和淋巴管内皮细胞中VEGFR-2和VEGFR-3的相对表达水平，可能会影响VEGF-C或VEGF-D诱发的主要血管生成(通过VEGFR-2激活)或淋巴管生成(由VEGFR-3驱动)的效果，这个假设是可信的。由于VEGFR-3参与肿瘤血管的维护、淋巴管内皮细胞上检测到VEGFR-2的表达等现象的发现，VEGFR-2和VEGFR-3信号通路在血管生成和淋巴管生成中互不相关这一观点已被复杂化［47，59，81，106］。此外，其他促进和抑制血管生成和淋巴管生成的调节剂，可能也调节VEGF-C和VEGF-D表达的生物学效应［53］。

(4) VEGF-A/VEGFR-2信号

VEGF-A已在许多人类和实验小鼠癌症中被确定为主要的血管生成因子，它在血管内皮细胞上表达，通过VEGFR-1和VEGFR-2发挥作用［107］。最近已证明，淋巴管与血管类似，也表达VEGF-A的受体之一VEGFR-2［46］。在多种肿瘤中VEGF-A的表达导致了淋巴管生成的增加。例如，当对皮肤中过表达VEGF-A的转基因小鼠进行化学处理诱发皮肤癌变时，可观察到表达VEGFR-2的肿瘤相关淋巴管活跃增殖，并伴随肿瘤转移到前哨和远处淋巴结［3］。同样，小鼠纤维肉瘤中VEGF-A的过度表达诱导淋巴管的生长，并经常检测到淋巴结转移［108］，而在原位乳腺肿瘤模型中和VEGF-A可观察到淋巴管密度的增加和淋巴结转移的增强［109］，在其他肿瘤模型中则无此现象［110，111］。在动物模型中VEGF-A对肿瘤淋巴管的不同作用，可能依赖于VEGF-A的表达水平，或模型中表达不同的VEGF-A剪切变异体，或附近淋巴管上VEGFR-2的丰度。

(5) 其他分泌生长因子

除了VEGF家族成员，其他分泌生长因子已被证明通过VEGFR-3依赖或非依赖的方式诱导淋巴管生成，并在某些情况下促进淋巴结转移。一项对纯化的LEC和BEC基因表达进行比较的分析发现，LEC的肝细胞生长因子受体(HGFR)表达水平显著高于BEC。而在正常组织的淋巴管中，HGFR则表达很少或根本没有表达，在发炎皮肤中活化的淋巴管上HGFR的表达明显增多。转基因表达或皮下注射HGFR配体肝细胞生长因子(HGF)，可促进小鼠的淋巴管形成，而全身阻滞HGFR可抑制淋巴功能［112］。在转基因乳腺肿瘤形成模型中，HGF被发现可促进癌周淋巴管形成，但没有观察到淋巴结扩散［113］。

血小板衍生生长因子(PDGF)-BB被证明在体外和体内都有淋巴管生成活性，在小鼠肿瘤模型中PDGF-BB的表达诱导淋巴管生成并促进淋巴结转移［114］。胰岛素样生长因子(IGF)-1和-2也已被证明可以在体内促进淋巴管生成［115］。更特别的是，在Lewis细胞癌模型中IGF-1受体的激活增加了VEGF-C的表达和淋巴结扩散，说明这条通路可以作为VEGF-C和淋巴结转移的正向调节剂［116］。IGF在许多人类肿瘤中表达，它们的表达与转移扩散和不良预后相关［117］。同样，成纤维细胞生长因子(FGF)-2可同时刺激血管生成和淋巴管生成，并引起VEGF-C的上调。FGF-2的作用可通过使用抗VEGFR-3抗体来抵消［118］。这些促淋巴管生长因子以及VEGF可作为设计抑制病理性淋巴管生成疗法的新靶标。

5.9.8 肿瘤中的淋巴管和促淋巴管生长因子

肿瘤细胞通过淋巴网络进行播散，是在包括癌在内的几种实体肿瘤中的一个共同发现。通过积极诱导“新淋巴管”的生长，肿瘤细胞获得对淋巴管网的通行能力，并最终转移到区域淋巴结［55，119］。局部淋巴结中肿瘤细胞的检测是肿瘤分期和治疗方案设计中的一个重要因素［70］。现在已经明确，通常扩张的癌周淋巴管与人类肿瘤转移的倾向有关;而瘤内淋巴管的重要性仍然不甚清楚。尽管瘤内淋巴管已在人类肿瘤包括宫颈癌、卵巢癌和黑色素瘤等中被检测到，但这些脉管被认为会由于肿瘤内的物理高压而塌陷，因此它们是无功能的［120］。瘤内淋巴管在转移扩散方面的功能意义仍然不明确［121］。

淋巴管密度已被证明与多种恶性肿瘤预后显著相关［122，123］。除了被证明能预测淋巴结转移的淋巴管密度，促淋巴管生长因子本身也被证明在几个关键的人类肿瘤中是预后的重要指标［70］。例如，在恶性黑色素瘤中，淋巴管特别是癌周淋巴管密度，以及促淋巴管生长因子的表达，在确定肿瘤转移的区域淋巴结方面有重要作用［124，125］。

在人类肿瘤中VEGF-C的表达有大量的临床证据。VEGF-C的表达已在乳腺癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、鳞状细胞癌、间皮瘤以及在神经母细胞瘤、肉瘤、黑色素瘤中被检测到。从头颈部鳞状细胞癌、甲状腺癌和肺癌中可以看出，VEGF-C的表达与淋巴结转移和不良的生存结果相关［126-129］。例如，在胃癌中，VEGF-C被证明可预测淋巴管密度的增加、淋巴管浸润和转移以及不良预后［130-133］。

也已发现肿瘤中存在VEGF-D。在淋巴结转移增加的乳腺癌中，VEGF-D的表达显著升高，且与无病生存率较低是独立相关的，并能够预测淋巴结转移和腹膜直接蔓延［134］。在子宫内膜癌中，VEGF-C的表达与肿瘤通过淋巴管和淋巴结转移的侵袭有关。此外，VEGF-D和VEGFR-3的存在与患者生存率的降低有关［104，135］。虽然公众防护意识和筛查措施日益提高，大肠癌仍然是成人发病和死亡的主要原因之一。使用淋巴管特异性标记的免疫组化染色显示，淋巴管密度的增加与区域淋巴结转移和肝脏转移呈正相关［136］。尤其，VEGF-C和VEGF-D的表达与淋巴结转移和不良疾病转归有关，而VEGF-D被认为是独立的预后指标，预示着大肠癌患者的无病生存率(DFS)及总生存率(0S)较低［137，138］。有趣的是，在肺腺癌和头颈部鳞状细胞癌中，VEGF-D的表达与淋巴结转移呈负相关［126，127］。VEGF-D在某些肿瘤中与转移相关，而在另一些肿瘤中则不相关，其中的原因目前仍不清楚［70］。

总体而言，肿瘤淋巴管密度的增加和肿瘤细胞向淋巴结的传播之间存在着因果关系，这反映了肿瘤中促淋巴管生长因子VEGF-C和VEGF-D的水平与转移性疾病之间存在关联的可能。因此，检测淋巴管的密度和促淋巴管生长因子的存在，可以为传统的组织学分析提供临床上有用的补充，以预测和确定哪些患者将被“划分”到一个新的分类当中，这类患者需要更积极的辅助治疗。

5.9.9 淋巴管生成在肿瘤扩散中的作用

虽然在临床标本中淋巴管的存在提示其与转移的相关性，但它们是否是转移途径中的活性成分这个问题仍然没有得到解决。促淋巴管生长因子及其同源受体的发现，使啮齿动物模型的建立得到发展，从而提供令人信服的证据表明肿瘤淋巴管生成可促进淋巴转移。例如，一个基于MCF-7人类乳腺癌细胞系的移植瘤［14］模型表明，VEGF-C的表达导致瘤周和瘤内淋巴管的增加，这与淋巴结转移率增加紧密相关。在另一个VEGF-C过表达的乳腺癌原位模型中，关于瘤内及瘤周淋巴管增加和区域淋巴结扩散增加的研究也获得了类似的结果［35］。在两个模型中都没有显著的血管新生出现，可能是由于产生的VEGF-C主要是未加工的形式，可优先结合并激活VEGFR-3(例如，诱导淋巴管生成信号转导)。

相比之下，基于表达人VEGF-D细胞的鼠移植瘤模型，不仅表现出肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移的增强，还表现出血管生成和实体肿瘤生长速度的增加，该作用可被VEGF-D中和抗体所抑制［36］。在这些肿瘤模型中，VEGF-C和VEGF-D促进肿瘤血管生成能力的差异，可能是由于在不同的模型中这些生长因子所受的蛋白水解加工程度不同［70］。在转基因小鼠胰腺癌模型中，胰岛β细胞VEGF-C的过表达增加了原发肿瘤周围的淋巴管生成，并增强细胞到引流淋巴结的传播［34］。在一个类似的模型系统中， VEGF-D诱导癌周淋巴管生成，同时伴随淋巴细胞积累和出血以及淋巴结和肺转移［139］。更重要的是，在可溶的VEGFR-3经转染肿瘤细胞产生或通过全身输入时，VEGF-C诱导淋巴管生成和淋巴结扩散的作用被抑制，这进一步验证了淋巴管在肿瘤扩散中的作用［33，140］。在皮肤过表达VEGF-A的转基因小鼠上诱导鳞状细胞癌时，VEGF-A能够促进肿瘤淋巴管以及血管生成，其信号显然是通过LEC上VEGFR-2的上调进行传导的［3］。

总的来说，来自动物模型的数据突出了淋巴系统和促淋巴管生长因子在转移方面的重要性。总体而言，促淋巴管生长因子通过增加肿瘤内和肿瘤周围淋巴管的数量，导致入侵肿瘤细胞和淋巴管内皮细胞之间接触面积的增加，从而增强转移。此外，由肿瘤细胞分泌因子引起的淋巴管内皮激活可能改变淋巴管内皮的黏附能力，促进肿瘤细胞和LEC的相互作用，或导致淋巴管大小的增加，从而促进肿瘤细胞进入淋巴管［18］。肿瘤细胞分泌的VEGF-C或VEGF-D也可能会增加血管通透性，或对肿瘤间质流体压力有重要影响，这可能促进肿瘤细胞进入淋巴管以及进入静脉［18，70，141］。

5.9.10 靶向VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3通路的临床应用

虽然手术、化疗和放疗等治疗方法已有很大进步，许多癌症的预后仍然很差，这凸显了对新的抗转移疗法的需求。通过同源受体酪氨酸激酶如VEGFR-3以可溶性生长因子VEGF-C和VEGF-D等的信号转导为靶点的治疗方法，包括单克隆抗体、可溶性受体、小分子抑制剂、多肽药物以及反义技术。这些针对VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3的治疗方法，不仅有可能阻止肿瘤的淋巴扩散，还可能抑制这个信号轴所促进的肿瘤血管生成、肿瘤生长和血行转移［142］。人源化的抗VEGF-A单克隆抗体(贝伐珠单抗)，是作为一种抗血管生成剂而设计的，已被证明可成功用于治疗转移性大肠癌［143，144］。与阻断VEGF-A以减少肿瘤血管生成类似，一项阻断VEGF-C和(或)VEGF-D与VEGF受体结合的研究，将有望用于抑制肿瘤淋巴管生成和淋巴转移以及限制肿瘤血管生成。在小鼠移植瘤模型中，一种阻断VEGF-D与VEGR-2和VEGF-3相互作用的中和VEGF-D的抗体(命名为VD1)，可抑制血管生成、淋巴管生成以及到淋巴结的转移扩散［36，145］。

除了中和抗体以外，还可通过VEGFR-3胞外结构域的一种可溶形式隔离VEGF-C和VEGF-D。肿瘤诱生淋巴管的衰退是通过摄入可溶性VEGFR-3实现的［140，146］。在小鼠皮肤上转基因表达可溶性VEGFR-3为其治疗潜力提供了进一步的证据，在模型中VEGFR-3可抑制胎儿淋巴管生成，并诱导已形成淋巴管的衰退，但是血管没有受到影响［48］。腺病毒介导的可溶性受体结构域转导，阻断了小鼠乳腺癌模型癌周淋巴管的增长，并在肺癌模型中抑制淋巴结转移，但没有抑制肺转移［140］。此外，VEGFR-2、VEGFR-3被证明在出芽血管上高表达，而联合使用可阻断 VEGFR-2 和VEGFR-3抗体疗法，可以对血管生成和肿瘤生长造成协同抑制效果。肿瘤血管和淋巴管上都有VEGFR-3的表达，在这两个方面对肿瘤生长和传播都有重要影响，使它成为既可抑制淋巴管生成又可抑制血管生成有吸引力的靶标［81］。

抑制肿瘤淋巴管生成的另一种方法是以促淋巴管生长因子的加工过程为靶点。通过阻断负责活化VEGF-C和(或)VEGF-D的酶，如血纤维蛋白溶酶和蛋白酶前蛋白转化酶家族成员，可抑制表达这些生长因子的肿瘤所诱导的血管生成和淋巴管生成［90，91，147，148］。负责活化的酶包括前蛋白转化酶家族和丝氨酸蛋白酶中的血纤维蛋白溶酶［89］。用VEGF-C和VEGF-D的单克隆抗体切断蛋白酶接触这些生长因子的途径，是一种可能的治疗方法。

可进入细胞并抑制VEGFR-2和VEGFR-3酪氨酸激酶活性的小分子抑制剂已经得到开发。在几种动物模型中VEGFR-2的酪氨酸激酶抑制剂可以阻断肿瘤血管生成，这些研究结果证明了该方法的治疗潜力［149］。临床批准的VEGFR-2和VEGFR-3小分子抑制剂包括索拉非尼(多吉美)，已用于治疗晚期肾细胞癌和肝细胞癌;舒尼替尼，可能为某些肿瘤如肺癌、肾细胞癌(RCC)和胃肠道癌等提供有针对性的治疗［150，151］。目前其他针对VEGFR-2和VEGFR-3途径且用于肿瘤治疗临床试验的小分子抑制剂，包括XL999、 CEP-7055、 PTK 787/ZK 222584 和 BAY 43-9006［152，153］。

5.9.11 未来发展方向

尽管血管生成已被广泛研究，淋巴管生成仍然是血管生物学中一个相对较新的领域。最近的研究已经发现了几个新的LEC特异性分子。通过基因敲除研究，这些分子已被证明在淋巴管的功能方面也非常重要，如PROX-1、VEGFR-3和平足蛋白。参与淋巴管形成的分子、淋巴管特异性标记的发现，以及纯化和培养LEC技术的建立，使人们能够更好地认识淋巴管在发育和疾病中发挥的作用。此外，生长因子VEGF-C、VEGF-D和其他淋巴管生成调节剂，以及特异性促进淋巴管生成信号通路的发现，使研究人员能够更好地理解淋巴管在促进肿瘤细胞传播中的意义。对阻断VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3信号轴的研究表明，靶向该信号轴可抑制肿瘤淋巴管生成，并抑制肿瘤细胞通过淋巴管转移扩散。

虽然VEGFR-3及其配体已在胚胎淋巴管生成、生长因子驱动的淋巴管生成，以及肿瘤模型中被广泛研究，但对VEGFR-3信号转导系统在其他生理和病理过程中功能的认识还只是停留在表面。此外，其他信号通路可能也有助于淋巴管生成，了解这些途径之间的相互作用具有重大意义。目前淋巴管亚型在淋巴功能尤其是在疾病状态如肿瘤中的作用还不清楚。淋巴管标记表达谱的分析，与形态、结构和分子上的区别相结合，可能有助于对单个淋巴管亚型的生物学特性进行研究。从促淋巴管生长因子和信号级联传导方面了解淋巴管发生、解剖、病理生理方面的复杂性，可能为人类癌症的治疗产生新的靶点。

［附: 相关专业名词解释］

(1) 前哨淋巴结:是肿瘤附近的第一个引流淋巴结。

(2) 基膜:是一种支持结构，可提供覆盖内皮细胞的物理屏障。角质细胞、腺上皮细胞和血管内皮细胞位于致密电子膜组成的基膜上，称为基底层。

(3) 腋窝淋巴结:是位于腋下的淋巴结。

(4) 原发肿瘤:是指出现在原始位点的肿瘤，在该位点肿瘤第一次发生。例如，原发性肺癌是在肺中发生的，而不是在其地方发生并扩散到肺。原始肿瘤有时也被称为“原发瘤”。

(5) 淋巴显像:是一种识别前哨淋巴结的方法。在肿瘤部位注入可被淋巴结摄取的放射性物质，在计算机屏幕上监控其运动。一旦摄取该物质的淋巴结被确定，它们可以被切除并进行病理检查，看是否含有肿瘤细胞。

(6) 周细胞:是一种细长的、相对未分化的、包裹在血管周围的结缔组织细胞。作为相对未分化的细胞，它可以作为这些血管的支撑，在必要时分化为成纤维细胞、平滑肌细胞或巨噬细胞。平滑肌细胞是具有伸缩性的细胞，也与血管有关。这两种细胞都参与了血流的调节。

(7) 胞饮:即通过内吞作用摄取溶解的物质;胞质膜内陷并夹紧，将小滴的液体放置在胞饮囊泡中;囊泡内装的液体随后慢慢转移到细胞质。胞饮主要用于细胞外液的吸收。

(8) 趋化因子:是由细胞分泌的小分子蛋白家族。被列为趋化因子的蛋白质有共同的结构特征，如体积小(分子量8000～10000)，以及在保守位点具有4个半胱氨酸残基。这些蛋白质通过与G蛋白相关的跨膜受体相互作用，发挥其生物学效应。这些受体称为趋化因子受体，有选择性地分布在其靶细胞的表面。趋化因子的主要作用是作为引导细胞迁移的化学引诱物。细胞被趋化因子吸引后以趋化因子浓度的增加为信号，朝趋化因子的来源运动。

(9) 在细胞生物学中，混合细胞群可通过磁激活细胞分选(MACS)或荧光激活细胞分选(FACS)来纯化。在MACS中，用以抗特异性表面抗原的抗体包被的磁珠孵育待分离的混合细胞;而在FACS中，细胞则用荧光结合的抗体孵育。FACS是一种特殊类型的流式细胞检测方法，它提供了一种将生物细胞的异质混合物分成两群或两群以上的方法，根据每个细胞特定的光散射和荧光特性，每次对一个细胞进行分群。在MACS中，表达目的抗原的细胞黏附到磁珠上，随后细胞溶液被转移到一个放置于强大磁场中的柱子上。此时，表达抗原的细胞黏附到磁珠上并留在柱子上，而其他细胞(不表达抗原的)则流过柱子。使用这些方法，细胞可以根据所表达的抗原被主动或被动地进行分离。主动选择时，表达这些抗原的细胞被洗脱到一个单独的容器中并收集。被动选择时，使用的抗体针对的是已知表达在不感兴趣的细胞表面的抗原。在将细胞/磁珠溶液转移到柱子上之后，表达这些抗原的细胞结合到柱子上，通过柱子的部分被收集，因为其中几乎不含表达非目的抗原的细胞。

(10) SNARE蛋白的主要作用:是介导细胞转运囊泡与细胞膜或细胞器(如溶酶体)的融合。Rab蛋白家族是单体G蛋白Ras超家族的成员。Rab GTP酶调节膜运输的许多步骤，包括囊泡形成、囊泡沿肌动蛋白和微管网络的运动以及膜融合，这些步骤组成了细胞表面蛋白质从高尔基复合体到质膜的运输，以及回收的路径。AAA或AAA+是与不同细胞活动有关的ATP酶的缩写。这些蛋白质参与许多进程，包括蛋白质的降解、膜融合、微管切断、过氧化物酶体生物合成、信号转导以及基因表达调控。AAA蛋白的特点是通过ATP酶将ATP水解提供的化学能进行耦合。半胱氨酸相关蛋白是分泌途径和蛋白质分泌ATP酶复合物的膜元件，也被称为易位子，负责将蛋白质分泌到细胞外环境。

(11) 受体酪氨酸激酶:是单跨膜结构域蛋白，包含细胞内的酪氨酸激酶结构域，通过与配体结合激活后，将一个磷酸基团从ATP上转移到一个酪氨酸残基上。激酶介导的蛋白磷酸化是调节酶活性的信号转导通路的重要机制。受体酪氨酸激酶尤为重要，因为其中某些有望成为肿瘤治疗的靶点。

(12) 旁分泌信号通路:是信号转导的一种形式，靶细胞位于信号释放细胞的附近。

(13) 与肿瘤相关的淋巴管通常被称为癌周淋巴管，包括位于肿瘤周边或瘤内的淋巴管。

(14) 异种器官移植(xeno来源于希腊语，意为“外来的”):是将活细胞、组织或器官从一个物种移植到另一个物种，如从人到免疫功能低下小鼠。这些细胞、组织或器官被称为异种移植物。

(15) 细胞、组织或器官可能被移植到接受者的正常位置，被称为原位移植。如乳腺癌原位模型中，乳腺癌细胞移植到受体小鼠的胸腔。

(16) 转基因小鼠在每一个细胞或特定细胞(如皮肤)中包含额外的人为导入的遗传物质。这往往赋予其新的功能。例如，该小鼠可能合成一种新的蛋白质。当整合的DNA干扰其他基因时，可能导致某些功能的丧失。转基因小鼠被用作与特定蛋白质过表达或错误表达相关的人类疾病的模型。

(魏金旺译，钦伦秀审校)

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