蛋白质组学在肿瘤转移诊断与个体化治疗中的应用

◎Mariaelena Pierobon，Alessandra Luchini，Alessandra Silvestri， Virginia Espina，Emanuel F. Petricoin，Lance A. Liotta

8.1.1 蛋白质组学和纳米科技在寻找肿瘤生物标记中的应用:临床需求面临生理学障碍

(1) 蛋白质组学有潜力满足寻找特异性肿瘤生物标记的需要

肿瘤常在晚期才能得到诊断和治疗，而此时肿瘤细胞往往已经发生了侵袭转移，各种治疗手段均效果有限。在早期甚至是癌变前期检测和诊断肿瘤，才有可能使现有或未来发展的治疗手段达到真正治愈。例如，即使那些接受最好外科和药物治疗的进展期卵巢癌患者，其5年生存率也只有35%～40%，但如能早期发现，常规治疗即可使其5年生存率达95%［1］。因此，早期发现本身就可能对肿瘤的成功治疗产生深远影响。符合临床应用标准的肿瘤早期诊断的生物标记，应能在血清［2］、尿液［3］或唾液［4］等易取得的体液中进行检测。临床蛋白质组学技术特别适用于发现此类生物标记［5］。血清和血浆是研究最偏爱的介质，这是因为它们是丰富的蛋白质信息库，包含着血液在组织中持续灌注和渗流过程中所记录信息的痕迹［6］。

尽管临床需求迫切，经过数十年的努力，仍未发现在常见肿瘤的早期检测中其特异性和敏感性均达到要求的单一生物标记。大多数研究者认为这是肿瘤的分子异质性和患者人群的流行病学异质性所致。因此，生物标记研究正渐渐远离寻找理想化的、单一的肿瘤特异性生物标记这一目标［7，8］。根据基因芯片研究的提示，生物标记研究的希望在于发现或构建由数十到数百个蛋白质和肽组成的标记群，这样才有可能克服生物的异质性，从而获得更高的诊断特异性。血清蛋白质组或多肽组学，为发现具有更高特异性的新的生物标记群提供了潜在的宝库［8］。

血清多肽组学是最有希望发现生物标记的新研究方法，因为它能够实时反映组织微环境［9］，而肿瘤本身就是组织微环境的产物(图8-1)。肿瘤微生态学是指通过细胞异常生长、血管生成、细胞浸润、炎症以及肿瘤细胞与宿主细胞间的互动过程，呈现的一种由脱落分子、生长因子和蛋白酶所构成的独特构象。

肿瘤新生血管的渗漏性以及肿瘤内静水压升高促进分子由肿瘤进入循环系统，从而使血液成为肿瘤生物标记更为理想的载体。肿瘤细胞在其微环境内死亡后，其降解成分也会进入循环系统。而细胞不同的死亡模式(凋亡或坏死)，也将产生不同的降解成分。因此，血液中的多肽组可动态记录组织微环境中细胞信号通信的分子级联变化。这种多肽组学标记群，对于肿瘤的早期检测具有更高的敏感性和特异性［9］。多肽组可望取代单一生物标记进行检测，以克服肿瘤组织和患者群体的异质性。

(2) 肿瘤早期诊断的生物标记:发现侵袭前的病变才是终极目标

大量研究证据提示，侵袭表型在肿瘤发展的很早期就已确定或形成［10］。以乳腺癌为例，以前认为导管原位癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)是癌前病变，在向浸润性癌的发展过程中存在一系列逐步进展的病变谱系，即DCIS要获得完整的侵袭和转移能力，必需获得更多的基因突变。

传统理论认为肿瘤的侵袭性多经历从低到高的逐步发展过程，且这个过程发生于肿瘤形成之后。近期研究发现肿瘤的侵袭能力在细胞的分子癌变过程中即被决定，远早于传统理论的认知。应用显微切割技术和基因表达谱技术对人乳腺癌样本进行研究，发现DCIS与来自同一患者的侵袭性癌，其基因表达谱极其相似，这提示乳腺癌患者的细胞分化类型和转移潜能早在DCIS阶段即已形成［11］。在MMTv小鼠的乳腺癌前病变组织中，发现大量乳腺癌干细胞相关标记的存在［12］。因此，从癌前病变到明显恶变表型的进展过程中，尽可能早的检测和治疗是肿瘤获得理想临床治疗效果的关键。

(3) 蛋白质组学识别敏感肿瘤生物标记的主要生理学障碍

大量论据提示肿瘤生物标记识别的主要重点应是检测处于癌前病变期、侵袭前期或转移前期的极小病灶。但Ⅰ期病灶的最大直径可能＜0.5cm，其可检测的生物标记水平非常之低(估计在每毫升皮克至飞克)，这就需要构建极其灵敏的生物标志物识别与检测技术平台。如果把目标从I期肿瘤检测提高到癌前病变的早期检测，无疑需要更高的灵敏度(甚至达到远低于每毫升飞克的水平)。这是一项非常艰巨的挑战，因为识别生物标记物的最敏感手段——基于质谱的蛋白质组学技术，其敏感性也难以达到每毫升几十纳克以下的水平［13-15］。

图8-1 组织微环境中产生生物标记的级联过程

注: 根据多肽组学的假设，循环中的多肽和蛋白片段来自组织微环境中的所有细胞;组织内蛋白水解产生的碎片进入循环系统;肽的特性及其裂解方式可提供有用的诊断信息(图来源: Petricoin，et al.［9］)。

卵巢癌是一个特殊的例子，使用传统的生物标记很难发现Ⅰ期肿瘤［7］。Brown和Palmer综合分析已发表的卵巢浆液性癌的相关研究数据，建立了关于隐匿性浆液性癌生长、进展及对其进行检测的模型，这些研究数据来自对BRCA1突变基因携带者进行预防性卵巢切除术所获得的标本［16］。他们的分析表明，在临床症状或体征出现以前，肿瘤处于原位癌、Ⅰ或Ⅱ期的时间平均超过4年，处于Ⅲ期或IV期的时间大约1年［16］。在隐匿期的大部分时间中，卵巢浆液性癌的直径＜1cm，因此在对卵巢和输卵管的常规检查中，肿瘤是难以发现的［16］。当浆液性卵巢癌进入进展期(Ⅲ期或Ⅳ期)时，其中位直径约为3cm。在浆液性卵巢癌进展到Ⅲ期前，要达到50%的检测敏感度，年度性筛查检测的肿瘤直径为1.3cm;而要达到80%的敏感度，这一检测标准需提高到直径仅0.4cm大小［16］。癌前病变等早期病灶，其组织体积可能＜0.1mm3。假设如此大小的组织，其所产生的生物标记均匀散布于人体总量约5000ml的血液体系中，其稀释系数将达到50000，这一密度水平远低于现有质谱技术的检测灵敏度。

由于生物标记的低丰度，对生物标记的发现及其常规检测量的设定来说，分析灵敏度都是一个挑战。在寻找生物标记的研究阶段，可能获得较大体积的血浆或血清(包括混合的多个样本)用于研究分析。但是，一旦候选标记用于临床，每个患者实际可提供的血液体积可能少于1ml。因此，候选标记分析平台的检测灵敏度必须达到亚飞摩尔( ＜10-12mol/L)或渺摩尔浓度。

除低丰度外，候选的生物标记必须被组织快速分泌，且必须可与血液中的高丰度蛋白相分离，这些高丰度蛋白如白蛋白和免疫球蛋白，在血液中的浓度是可能的候选标记的10亿倍数，而疾病最相关的特定蛋白只是细胞蛋白质组中的一个较小亚群。因此，发现生物标记所面临的最大挑战之一，就是从血液蛋白质的高浓度复杂混合物中，分离出非常罕有的候选蛋白质。

最后的主要挑战是生物标记自身的不稳定性。血液中的生物标记可能是高度不稳定的，其在血液的收集、转运和储存过程中都会降解。这种不稳定性是研究中验证偏倚的重要原因，并阻碍其常规临床应用。

(4) 纳米技术用于克服生物标记基本的障碍

如前所述，研究者迫切需要既能增强生物标记发现和检测灵敏度，又不提高非特异性背景信号的技术。有人已开发出一种新的核心外壳/亲和诱饵纳米技术，这种新技术能够克服疾病相关的生物标记发现和检测过程中的3个主要障碍:①超低丰度( ＜1ng/ml):对于源自早期肿瘤和小体积恶性病灶的生物标记，传统的生物标记检测技术无法测量。②被血清蛋白质掩盖:生物标记必须从那些超过其自身浓度多达10亿倍数量级的血液常驻蛋白中分离。③降解:生物标记在血液收集过程中，是高度不稳定和易变性的［17-20］。捕获型纳米微粒(0.5μm)可以在几分钟内一步到位地迅速进行溶液中目标分析物的亲和捕获，百倍浓缩，完全去除血清免疫球蛋白和白蛋白，并防止被捕获分析物的降解(图8-2)。

图8-2 捕获型纳米微粒运作示意图

注: (A)纳米微粒由一个含诱饵的核心和一个筛壳构成。核-壳纳米微粒被引入复杂的体液(如血液)，液体内有浓度极低且非共价结合到白蛋白等载体蛋白的生物标记。(B)核-壳纳米微粒分离并结合生物标记，同时完全去除载体蛋白。(C)浓缩机制(改编自参考文献［18］)。(D)纳米微粒的原子力显微镜图像显示均匀的粒度分布(改编自参考文献［20］。)(E)ELISA结果表明，血清中的血小板衍生生长因子(PDGF)被纳米微粒浓缩(改编自参考文献［18］)。

我们已经合成了核-壳纳米微粒的水凝胶，由多聚N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和亚甲基双丙烯酰胺(BIS)交联而成。纳米微粒结合多种高亲和饵剂，可以目的性的亲和体液中的主要肿瘤生物标记，即蛋白质和多肽(如膜蛋白、核蛋白、胞质蛋白及分泌性可溶蛋白)、代谢分子和核酸［20］。诱饵以非常高的亲和力(大于大多数抗体的亲和力)，化学识别靶蛋白的立体构象，可以在5分钟之内分离整个液相中的几乎全部目标生物标记［18，19］。所捕获的分析物容易洗脱以便进一步分析。例如，血清中的PDGF-BB以及尿中的人生长激素等生物标记因极度稀释而难于检测，核-壳微粒能将其浓度提升到商业化的临床免疫分析平台可检测的范围［18］。一套冻干的亚微米大小的捕获型微粒，携带已知等级生物标记的特异性亲和诱饵，被引入测试血清，各微粒群分别亲和捕获其靶分子，可以一次性地在整个液相样本中，将亲和捕获的目标分析物浓缩在微粒中。分析物能以小体积洗脱，从而浓缩到较原始样本高得多的浓度和纯度。对于500μl的起始样本，此技术能在几分钟内将目标生物标记浓缩数百倍，同时完全防止其降解。

这种能够结合血清中特定极低浓度肿瘤标记的智能纳米微粒有望成为体内应用的血清捕获介质［21］。将来可注入患者体内，以搜寻、亲和并浓缩肿瘤或疾病的极低浓度目标标记。纳米微粒亲和目标后，可即时自血清中被“捕获”以用于诊断或监测疾病进展。

(5) 减少肿瘤生物标记发现阶段的偏倚

生物标记领域的理论基础是循环中的分子组分是细胞和器官系统功能的真实镜像［22］。由于多肽不断持续的日常生理活动而不断发生变化，这意味着血液中的多肽亚群可精确反映组织中的细微疾病事件。流行病学家和临床化学家一直担忧各种非疾病相关的流行病学因素和正常生理条件可显著影响血液中单个生物标记的水平，所以在多肽组学生物标记的转化研究中，任何生物标记的发现和确定(单一或群组)需非常谨慎，以减少发现阶段和验证阶段的样本偏倚［23］。

要做到这一点，首先要建立具有严格对照的研究组。研究组中的血清或血浆样本应由以下来源组成:①经组织学证实的肿瘤患者;②良性或炎性非肿瘤疾病患者;③健康人群对照或医院对照，并根据预期目的加以选择［24］。从发现研究开始，研究样本就应包括那些来自无肿瘤但有炎性疾病、反应性疾病或良性病变患者的样本。这一原则对于确保从研究开始阶段所富集的标记即为肿瘤特异性标记至关重要。而且，对肿瘤的研究也非常关键，尤其是肿瘤几乎总发生在炎症背景下，而这种炎症背景又是肿瘤自身发病机制的一部分。由于蛋白质组对这些非肿瘤进程可能特别敏感，所以必须小心地最大限度地减少非肿瘤特异性标记被选择的机会。事实上，在进入研究阶段之前，关键的准备工作就是减少这些潜在的前期偏倚［24］。下一阶段才是多肽分馏、分离、提取、富集、浓缩和基于质谱分析(MS)的识别过程［15，25］。

建议对每份研究样本都采用叠代和重复的质谱分析以及MS/MS测序［26］。候选多肽如能经多次叠代分析得以重复鉴定，无疑其正确性更大。最终能筛选出一系列在肿瘤和对照人群中丰度不同的候选诊断标记名单。下一步是寻及或构建每个候选肽标记的特异性抗体或其他配体［23］。在抗体特异性完成验证后，此抗体即可应用于肿瘤和非肿瘤组样本中，进一步验证肽标记的存在［27］。

新一代多反应监测(MRM)质谱技术可定量识别多肽，由于其高可信度，无需抗体验证［28］。尽管如此，我们的目标仍是发展一组候选肽生物标记，其检测不依赖于分析技术，并最终能常规临床应用。候选生物标记的临床验证从确保测量平台的灵敏度和精确度开始。在测量平台的可靠性和可重复性被证明之后，才可进行临床研究。

临床验证过程中最终和最关键的阶段是生物标记群的双盲试验。试验在独立的(发现组中未经使用的)大样本量的临床研究组中进行，这些临床研究组最好来自3个以上的不同地区［24］。为保证足够的统计能力，这些测试组的样本量大小应根据平台验证阶段肽分析物群的表现以及分析物的预期临床用途合理设置。要强调的是，如假定测试目的是临床常规应用，试验测试人群的敏感度和特异度性应可转化为阳性预测值。真正的阳性预测值具有指导应用和提示肿瘤患病率(或在目标人群中其他疾病状况)的功能。在高癌症遗传风险的患者群中，预期的肿瘤病例比例高于一般人群。因此，后者的假阳性率要高得多。出于这个原因，最终是否采纳一个基于多肽组或蛋白质组的测试，关键取决于其预期使用的临床环境。

最后，采血方案和对照组的设定应该标准化［23］，应用检测的新型仪器也应具备足够的灵敏度和可重复性［29］，以及在完整的CAP/CLIA监管指导下进行广泛的临床试验验证，才能充分了解多肽组中蕴含的全部信息量。

8.1.2 理解和治疗人类组织微环境中的肿瘤转移

(1) 显微切割技术可用于肿瘤侵袭和转移的微观分子分析

要真正理解疾病进展的微生态学，必须对组织环境中纯粹细胞群进行分子分析［30］。这比仅磨碎一块组织然后将所提取的分子用于一系列化验要困难得多。组织是由许多不同种类但又相互作用的细胞群所构成的复杂三维结构，研究者感兴趣的细胞亚群可能仅为其中的一小部分。如同计算机领域“如果输入垃圾数据，输出的数据也必定是垃圾”的定律一样，使用高端技术对复杂组织的提取物进行分析，如果原始材料就已被错误的细胞污染，研究结果必然会受到严重影响。从新鲜组织培养细胞是减少这种污染的方法之一。然而，培养所得的细胞并不能准确地反映其源组织实际微环境中的分子事件。因此，细胞异质性问题一直是正常和病变组织分子分析的重要障碍。

为解决这一问题，我们开发了激光捕获显微切割(LCM)技术，使科学家能够在显微镜直视下，快速而可靠地从组织中捕捉和保存特定细胞［31-33］。应用显微切割肿瘤组织抽提的m RNA已被用来作为制备c DNA文库、芯片微阵列、差异显示和其他技术的原始材料，以寻找新的基因或基因突变［34］。LCM技术的发展，允许研究者确定组织中特定蛋白的表达模式［35］。使用多重分析，研究者可以将基因表达模式和蛋白质翻译后修饰与组织病理学和治疗反应等关联起来［35］。LCM技术可用于研究器官或组织微环境中细胞亚群之间的相互作用。有效地联合串行组织切片LCM技术和多重分子分析技术，可以建立敏感和定量的检验方法，以显示组织形态元素之间的三维相互作用。我们的目标是将组织形态发生学和病理学、分子系统生物学相整合。

LCM对肿瘤侵袭转移研究领域产生了两个重要贡献。首先，现在可以研究在人体组织中参与从原位癌向浸润性癌转化的单个细胞和细胞群［36］。LCM可用于从任何类型的组织中获得人类肿瘤进展所有阶段的癌前病变细胞，可直接从仅数微米的亲代DCIS或前列腺上皮内瘤(PIN)的病变本体中分离出微转移的乳腺癌或前列腺癌细胞［11］。其次，LCM提供了对转移的肿瘤细胞与原发肿瘤中的肿瘤细胞进行比较的手段［37，38］。

(2) 从功能基因组学跨越到肿瘤蛋白质组学

蛋白质组学在生物医学研究中的应用已达到了非常复杂的水平。该领域已从简单的编码蛋白质跨越到研究良性和恶性细胞间改变的阶段。现在蛋白质组学研究的目标已包括将蛋白质组的信息整合到细胞和组织的功能通路中［39］。这种综合必须考虑到蛋白翻译后修饰、蛋白质间或蛋白-DNA/RNA间的相互作用、信号通路间干扰，以及胞内、胞间和组织间反馈调节的动态情况。这种对功能更高层次的理解，将成为对人类疾病基础分子病变设计出真正合理治疗方案的基础［40］。

DNA是信息的存档，而蛋白质实际执行了细胞的所有功能，特定DNA序列的存在并不能保证相应蛋白质的合成。而且，蛋白质的复杂性和多能性取决于翻译后修饰的过程。核酸谱(包括microRNA)并不提供蛋白质如何连成网络以及蛋白在细胞内功能机制的信息。事实上，可以引起细胞迁移、死亡或分裂的蛋白信号通路，在DNA/RNA的基因表达发生任意改变之前就能直接激活。因此，正是源于蛋白分析的技术方法推动了分子医学革命从相关性发展到因果性阶段。

虽然个体化治疗在医学中已应用多年，但目前其在肿瘤治疗中所取得的进展，需要更精确地定义和识别那些可通过新靶向药物获得最大受益的患者。已证实基于基因表达阵列的分子标签可用于对肿瘤患者人群的分类［41，42］。然而，转录表达谱只提供了一个与临床重要特征相关并不断变化分子网络的不完整画面。首先，基因转录水平与蛋白表达或编码蛋白质的功能形式(通常是磷酸化)并不存在显著相关;其次，有关蛋白质相互作用和细胞信号通路的状态，RNA转录也只能提供很少的信息;并且，目前大多数治疗方法直接针对的是蛋白靶点，这些靶点往往是蛋白激酶和(或)它们的底物［43］。人类激酶组，即人类基因组编码的全部蛋白激酶，包括细胞的分子网络和信号通路［44］，这些蛋白和分子网络的活化状态依据细胞微环境而不断波动。因此，分子谱研究的原材料，需要从体外模型转向使用于真正的病变人体组织。这样，可大致勾画和评估真实生物环境中人类激酶组活性的技术，将提供新的丰富分子信息，也是实现患者个体化治疗的关键［5，37，38］。

(3) 指导患者个体化治疗的蛋白芯片工具

理论上讲，确认患者对一个给定治疗是否有反应的最有效方法，是在治疗前就确定每一位患者中哪些潜在的信号通路被真正激活［45］，这需要对患者活检而获得的组织标本进行分析。通常活检标本中可能仅采集有数千个细胞，传统的蛋白质组学技术对这样非常小的组织样本进行分析时会有明显的局限性。

蛋白芯片代表着一种新兴技术，可以解决先前检测平台的局限性，并正在迅速成为药物开发、生物标记鉴定以及细胞物质信号转导解析的有力工具［44］。蛋白芯片的优势在于其有能力提供已知细胞信号蛋白图谱，能够反映一般情况下在独立样本中流过蛋白网络的信息［37］。蛋白网络中关键节点或相互作用的识别，是药物开发和(或)个体化治疗方案设计的潜在出发点。以整体性高通量的方式研究蛋白质识别活动(磷酸化)的蛋白芯片，可以用来完成基因芯片不可能做到的方式，剖析细胞信号通路的工作状态［46］。

蛋白芯片可用于监控随时间推移的蛋白磷酸化改变(包括治疗前后、疾病和非疾病状态之间以及有效者与耐受者之间)，容许研究者推断出在特定通路中的实时蛋白质活性水平，以针对每个病人的细胞通路设计个体化治疗方案［39］。特异性地针对关键通路中靶蛋白修饰或激活状态的高质量抗体的日益增多，将会大大促进这项技术在临床分子诊断中的应用。考虑到生物蛋白的复杂阵列在细胞裂解液中浓度的千差万别，抗体特异性尤为关键。很多时候，最终用于分析的来自显微切割或活检组织的真正肿瘤细胞，其数量可能低至数千个［47］。假设感兴趣的蛋白及其磷酸化产物均为低丰度，样品中待测蛋白的总浓度将非常低。新一代具有高度敏感性和特异性抗体的蛋白质芯片，对于仅含不到数千个细胞临床标本的分析，仍能达到足够的灵敏度。

一般蛋白芯片由一系列固化点组成，每个点包含同质或异质的饵分子，芯片阵列可用探针(标记的抗体或配体)或含有目标分析物的未知生物样品(例如细胞裂解液)来检测。当要检测的分子直接或间接被信号生成基团所标记后，在芯片阵列中会产生阳性和阴性的点。每个点的信号强度，与饵分子绑定的所用待测分子的量成正比。点阵的构成图像被捕获、分析并加以解释。

蛋白芯片分为两大类，即正相阵列(FPA)蛋白芯片［48］和反相阵列(RPA)蛋白芯片［45］，这取决于感兴趣的一个或多个分析物是从液相捕获还是绑定到固相。FPA的捕捉分子固化在基质作为诱饵分子。FPA的每个阵列由一个测试样本(例如一份细胞裂解液)孵育，一次可测量多种分析物。其在肿瘤研究中应用的例子包括:确定以电离辐射治疗的肿瘤细胞在蛋白水平的改变［49］和血清蛋白生物标记的识别［46］。

尽管潜力巨大，抗体芯片的应用目前仍受限于能否具备高特异性的抗体。抗体芯片常规应用的另一个障碍是芯片上已绑定分析物的检测方法。目前的选择包括使用特异性抗体，以从捕获抗体确认独特的分析物表位(类似于传统夹心式ELISA)，或将直接标记的分析物用于芯片探测。这两个技术都面临着不同的技术挑战。相比FPA，RPA固化单个测试样本于每个阵列点，如此一个芯片阵列由数百个不同患者的样本或细胞裂解液构成。RPA不仅限于临床应用，也为筛查如活检标本这样的极少细胞量的临床样本提供了机会。由于人体组织由数百种相互作用的细胞群构成，RPA联合LCM为发现反映细胞微环境的细胞蛋白质组的变化提供了独特的机会。

RPA检测分析物极为敏感，对于给定蛋白其检测水平接近阿克(attogram)级别，而且方差小于10%［5］。RPA的检测灵敏度很高，可检测到少于10个细胞的斑点裂解物中低丰度的磷酸化蛋白异构体。对于源自活检标本的仅仅数百个细胞，这种敏感度及分析稳定性至关重要。由于RPA技术对每个分析物只需一种抗体，为分析数百个磷酸特异性待测物中的通路提供了简便的途径。最重要的是，RPA的敏感性显著高于微球阵列或ELISA，可用于临床组织样本的分子网络筛选。多项研究已证明反相蛋白质芯片在人体组织分析中的效用，展示了该技术的潜力［5，11，37-39，45，46，48-50］。

RPA技术非常适用于评估突变型与野生型细胞之间的信号差异，这些研究目前正在进行。可以设想未来的病理报告不再是对所选待测物的单一测量，而是包括许多相关的特定下游靶点及所有类型信号通路的功能状态，并对待测物中磷酸化蛋白质组进行整体描绘，以此指导制定治疗决策和预测预后。肿瘤微环境、宿主和外周循环的蛋白和信号通路构成的分子谱，在有效地选择治疗靶点和患者分层方面大有前途(图8-3)。许多常见散发性肿瘤，在细胞信号转导、组织行为以及对化疗的敏感性方面存在显著异质性。因为蛋白组学分析技术具有同时研究多种通路的能力，在这类肿瘤的研究中特别有用。通过对大量标本的异常信号通路进行归类，这些必要的数据为制订联合疗法提供了合理的基础。这些联合疗法可能比单一疗法更有效，将有助于最大限度地克服肿瘤异质性问题。蛋白质组学分析较之单独的基因转录谱更为可靠，由此产生的预后特征源自药物靶点(例如活化的蛋白激酶)而不是基因，所以这种对信号通路的分析为获得治疗缓解提供了方向。因此，磷酸化蛋白质组通路分析可用于诊断、分析预后和指导治疗性干预。

图8-3 转移性肿瘤个体化治疗路线图

注: 转移性肿瘤个体化治疗包括活检或针吸获取样品，激光显微切割，信号转导通路分析，使用蛋白质微陈列进行磷酸化蛋白组学分析和RNA转录分析。特定的信号通路指纹是进行患者个体化干预治疗的基础。通过后续活检和对信号分子指纹的重新评估来进行疗效评价(改编自参考文献［5］)。

(4) 组织中蛋白质生物标记的稳定性——未满足的关键需求

在确认、研究和解决组织中蛋白质生物标记的不稳定问题之前，其提供诊断和治疗信息的前景始终有不确定性［51］。迫切需要建立标准化的程序和新的技术，以在常规临床环境中识别那些无缝收集和即时保存组织中的生物标记蛋白，尤其是已发生转录后修饰的蛋白(如磷酸化蛋白)。

虽然研究者担心血管阻断和麻醉的影响，但影响更为显著且被低估的问题是被切除的组织实际上依然存活并对外部刺激有反应［51］。活检组织自患者移除的瞬间，组织内的细胞对血管缺灌注、缺血、缺氧、酸中毒、细胞废物堆积、电解质缺乏和温度变化就产生了反应和适应。在切除后短短的30分钟内，无论在手术室内或者在病理学家的切板上，组织中的蛋白信号通路就可以发生急剧的变化。这可能在组织中诱发压力相关、缺氧相关以及创伤修复相关蛋白信号通路的蛋白和转录因子的大量激增。随着时间的推移，候选蛋白组学标记(或RNA)的表达水平可能显著波动［51］。相比体内的标记状态，这将极大地改变组织内的分子征象。此外，在病理微环境的影响下，体外变化的程度在不同组织类型可能完全不同。

(5) 甲醛固定可能并不合适:分子保存化学问世

虽然现在已经能够从甲醛固定的组织中提取蛋白，但由于甲醛固定所需的时间较长，对于磷酸化蛋白分析可能不是最理想的处理过程。甲醛的组织渗透率是0.1mm/h，因此在渗透的同时，组织深处的细胞分子将会明显降解［52］。甲醛交联可以在蛋白质酰胺基之间形成亚甲基桥，封闭待测表位，同时减少从组织中抽提的蛋白数量［52］。由于组织的大小和采样区块的深度等都是未知变量，对于分子诊断的蛋白质和磷酸化蛋白，甲醛固定可能导致其稳定性显著变化。磷酸化及去磷酸化的结构蛋白和调节蛋白是细胞内的主要调控机制。具体过程为:蛋白激酶从ATP转移一个磷酸基到一个特定的蛋白质，磷酸酯酶移除磷酰基团，还原蛋白质到其原有的去磷酸化状态。因此，上述磷酸化-去磷酸化循环可被视为一个分子切换开关。在细胞微环境内的任何时间节点，蛋白质的磷酸化状态是由磷酸化残基特异性的相关激酶和磷酸酯酶组成的局部化学计量的一种功能状态。在体外的时间段，如果细胞依然存活，可以想象某些蛋白质的磷酸化状态可以发生瞬时变化［51］。

因为有多种激酶/磷酸酶的化学性和蛋白性抑制剂，足以用来设计合理的稳定剂，以保持磷酸化蛋白的稳定性而无需冷冻。在不久的将来，保护性化学试剂可用于手术室及门诊，组织的分子完整性可在获取时被立即保留。这种化学试剂未来会用于保存蛋白质、RNA及组织形态。此外，这种化学试剂可作为加工标准石蜡块的起点。这样，分子分析谱可以无缝集成到常规外科手术及病理诊断中去。

获得细胞水平上的分子信息是肿瘤转移个体化治疗的关键，因为驱动转移克隆生长和生存的分子通路是组织环境中的产物［53］。以原发瘤细胞为目标的治疗方法，可能无法有效地治疗其转移病灶。这是因为转移细胞已适应了自身生存及定居靶器官的微环境，这种微环境和原发肿瘤的微环境是完全不同的［54，55］。例如，原发性结直肠癌的发生位置即结肠黏膜的微环境，与其常见转移靶器官肝实质内的微环境就颇为不同［37］。

(6) 肿瘤转移的个体化分子靶向治疗

正如图26-3中总结的那样，利用新的技术，现在可以仅仅通过一次穿刺活检，就能绘制出肿瘤细胞蛋白信号通路的激活状态。LCM［31-33，56］和反相蛋白芯片(RPMA)［45］这两种技术已解决了组织细胞异质性问题，满足了对少量细胞的治疗性药物靶点活性进行解析的需要。现在这些技术的应用，对转移灶进行个体化分子靶向治疗成为可能［37］。

个体化肿瘤转移治疗应按照以下步骤进行:①应用显微切割技术从转移灶获得纯净的肿瘤细胞群。②裂解肿瘤细胞及分析其信号通路的激活状态，这些通路中含有一组分子靶向抑制剂中的一个或多个药物靶点。③与患者转移灶中激活的信号通路相匹配的药物是这组分子靶向抑制剂中的最佳药物［37］。例如，如果EGF途径在转移灶中激活，表现为EGF受体的磷酸化及下游端点蛋白的磷酸化(如Akt和ERK)，那么EGF通路的抑制剂(酪氨酸激酶抑制剂或单克隆抗体)可能更适合于患者［56］。

这个概念不再是未来的梦想，而是今天的现实。在作者的实验室中，转移的个体化分子靶向治疗正处于临床试验的评估阶段。此试验首次针对合并肝转移的IV期结直肠癌患者，在立体定向指导下取得肝转移灶的活检样本，获得的组织以LCM处理并接受RPMA分析。对含有酪氨酸激酶抑制剂靶点的信号通路的激活水平进行打分，依据得分对患者进行分层，以此判断是否接受一种能够敲除转移灶中相应通路分子靶向抑制剂的治疗。在本章编写之际，该试验入组人数已达到患者目标累积数的1/10。

(王骥 译，钦伦秀 审校)

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