基因分子诊断报告检测结果为0

人类遗传病的正确诊断是建立遗传咨询、开展防治工作的前提。与非遗传性疾病的诊断一样，遗传病的诊断也是首先通过患者的病史、症状、体征、实验室检查及其他特殊诊断措施而建立初步诊断的；但它不同于一般疾病的是往往还需要进行系谱分析、生化遗传学、细胞遗传学、分子遗传学等遗传分析，从而进一步确定该病可能的遗传方式。目前，临床上遗传病的常规诊断往往包括以下几种情况：①临症诊断；②症状前诊断；③产前诊断；④植入前诊断。

一、临症诊断和症状前诊断

临症诊断（symptomatic diagnosis）是根据患者的各种临床表现进行检查、确诊和判断遗传方式，是遗传病诊断的主要内容。症状前诊断（presymptomatic diagnosis）则是对有遗传异常的个体采用各种措施，使他（她）们在出现症状前从遗传上予以确认，从而既有助于“患者”在其组织器官尚未出现器质性病变前的有效治疗，也有助于遗传咨询，即对那些尚未表现出症状的严重遗传异常者进行劝阻结婚或绝育后再结婚。

（一）病史、症状和体征

1.病史 病史采集主要是通过采集对象的主观描述和相关个体的病案查询来完成，同时还要收集家族史、婚姻生育史和患者发病时间等相关信息。遗传病大多有家族聚集倾向和特定的遗传规律，因而病史采集的真实性和完整性对后续的分析和研究至关重要。另外，还要根据不同的遗传病进行特定的调查。著名医学家Childs曾明确提出：“未能采集完整的家族史是令人遗憾的医学（to fail to take a good family history is bad medicine）。”

2.症状与体征 遗传病具有与其他疾病相同或相似的体征，可能还有其特异性，这些都为初步诊断提供线索。大多数遗传病在婴儿或儿童期就有相应的体征和症状。因此，除观察体貌特征外，还要注意患者的身体生长发育、智力发育、性器官和副性征的发育是否存在异常。

（二）家系分析

根据对患者及家族成员发病情况的调查结果绘制系谱，极有助于区分单基因病和多基因病，以及遗传方式。系谱分析时应注意完整性和准确性。在单基因遗传分析中要特别注意外显不全、延迟显性、显性及隐性的相对性、新的突变产生、遗传印记、动态突变、线粒体病的进行性，以及遗传异质性等问题，避免误判和发病风险的错误估计。

（三）细胞遗传学检查

细胞遗传学检查，即染色体检查与核型分析，是应用较早的遗传病诊断手段。随着显带技术，特别是高分辨染色体显带技术的出现和改进，能够更准确地判定和发现更多的染色体畸变，确诊新的微小畸变综合征。利用染色体显带技术，还可以对某些疾病在染色体水平发现一些原发性改变，如肿瘤、发育缺陷、心血管疾病等，把疾病相关基因确定在一个较小的范围内，便于进一步研究。

用于染色体检查的标本主要有外周血、绒毛、羊水中胎儿脱落细胞、胎儿的脐带血，以及骨髓、胸腔积液、腹水、手术切除的病理组织等。染色体检查适应证包括：①明显智力发育不全者；②生长迟缓或伴有其他先天畸形者；③夫妇之一有染色体异常，如平衡异位、嵌合体等；④已生育有染色体异常或先天畸形患儿的夫妇；⑤多发性流产妇女及其丈夫；⑥原发性闭经和女性不孕症者；⑦无精子症和男性不育症者；⑧两性畸形者；⑨疑为先天愚型的患儿及其父母；⑩智力低下并伴有大耳、大睾丸和多动症者；30岁以上的高龄孕妇等。

染色体原位杂交是应用标记的DNA片段（探针），与玻片标本上的细胞、染色体，以及间期的DNA或RNA杂交，对特定核酸片段位置和定量分析的技术。通常采用生物素、地高辛等标记探针，原位杂交后，用荧光染料标记的生物素亲和蛋白、抗亲和蛋白的抗体进行免疫检测和杂交信号放大，使探针杂交的区域发出荧光，这种方法称荧光原位杂交（FISH），具有灵敏度高、特异性强特点，可以检测染色体微小结构异常，也可应用在基因定位和基因制图等领域。另外，双色FISH、多色FISH、染色体涂染和比较基因组杂交（CGH）等先进技术的应用，都已大大提高了染色体畸变的检出率和准确性。

（四）生化检查

生化检查是遗传病诊断中的重要辅助手段，包括临床生化检验和针对遗传病的特殊检查，主要是对由于基因突变所引起的酶和蛋白质定量和定性分析，对单基因病和先天性代谢病进行诊断。

目前已知的多种遗传性代谢病中，一般由于基因突变、基因缺失、基因表达失调或翻译后加工修饰缺陷所致。临床主要对酶活性和代谢产物进行检测，以血液和尿液为主要检材，可采用滤纸片法和显色反应进行检测。随着对遗传病发病机制认识的不断深入和检测方法的改进，生化检测将更加简便、快捷。

（五）基因诊断

基因诊断是指利用分子生物学技术，检测DNA、RNA结构或基因表达水平变化，从而对疾病做出诊断的方法。

二、产前诊断和植入前诊断

产前诊断（prenatal diagnosis）是以羊膜穿刺术和绒毛取样等技术，对羊水、羊水细胞和绒毛进行遗传学和生化检查分析，对胎儿的染色体和基因进行分析诊断，是预防遗传病患儿出生的有效手段。

（一）产前诊断的对象

根据遗传病的危害程度和发病率，可将产前诊断的对象排列如下：①夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或生育过染色体病患儿的夫妇；②35岁以上的孕妇；③夫妇之一有开放性神经管畸形，或生育过这种畸形患儿的孕妇；④夫妇之一有先天性代谢缺陷，或生育过这种患儿的孕妇；⑤X连锁遗传病致病基因携带者孕妇；⑥有习惯性流产史的孕妇；⑦羊水过多的孕妇；⑧夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇；⑨有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。

应当注意，已出现先兆流产、妊娠时间过长及有出血倾向的孕妇不宜做产前诊断。

（二）产前诊断的方法

产前诊断的常规方法包括无创（伤）性和有创（伤）性两类。无创性方法有B超检查，孕妇血液与尿液检测，CT、X线和磁共振成像检查等；有创性方法有羊膜穿刺、绒毛取样和胎儿镜等。

1.B超检查 B超是一种相对安全无创的检测方法，是首选的诊断方法，能够详细检查胎儿的外部形态和内部结构，可对多种遗传性疾病进行早期诊断。这些疾病包括：神经管缺陷、脑积水、无脑畸形；唇、腭裂，颈部淋巴管瘤；先天性心脏病；支气管及肺部发育异常、胸腔积液；肢体缺陷；先天性单侧肾缺如、多囊肾；先天性幽门狭窄、先天性巨结肠等。

图16－1 羊膜穿刺示意图

2.羊膜穿刺法 羊膜穿刺技术是产前诊断的基本方法之一，即在B超的监护与引导下，无菌抽取胎儿羊水（图16－1），对羊水中的胎儿脱落细胞培养，进行染色体、基因和生化分析。例如，羊水中甲胎蛋白浓度过高时，提示胎儿可能有脊柱裂、脊髓脊膜膨出和脑积水等异常。羊膜穿刺操作一般在妊娠15～17周进行，此时操作发生感染、流产及其他妇科并发症的风险相对较小（约1％）。

3.绒毛取样法 绒毛取样法在妊娠早期诊断中最为常用，一般于妊娠10～11周进行。该技术也是在B超监护下，用特制的取样器，从孕妇阴道经宫颈进入子宫，沿子宫壁到达取样部位后，吸取绒毛枝（图16－2）。绒毛取样的优点是检查时间早，根据检测结果认为有必要进行选择性流产时，给孕妇带来的损伤和痛苦相对较小。缺点是取样标本容易被污染，胎儿和母体易感染和操作不便等，引起流产的风险是羊膜穿刺法的2倍。

图16－2 绒毛取样法示意图

绒毛样本可用于诊断染色体病、代谢病、胎儿性别鉴定、生化检测和DNA分析。

4.脐穿刺 脐穿刺是指在B超的监护下，用细针经腹壁、子宫壁进入胎儿脐带，并抽取胎儿血液样本进行诊断。本方法适宜于妊娠18周进行，常作为因错过绒毛或羊膜穿刺取样最佳时机，或羊水检查失败的补救措施，还可检测胎儿血液系统疾病及先天性免疫缺陷等。

5.胎儿镜检查 此检查又称羊膜腔镜或宫腔镜检查。宫腔镜进入羊膜腔后，可直接观察胎儿是否有畸形及胎儿性别和发育状况如何，可同时抽取羊水或胎儿血样进行检查，还可进行宫内治疗。因此，从理论上来说，这是一种最为理想的方法，但由于操作困难和易引起多种并发症，目前还不能被广泛接受。胎儿镜检查的最佳时间是妊娠18～20周。

6.分析孕妇外周血中的胎儿细胞及游离的胎儿DNA或RNA 目前用于产前诊断材料的获得，对于胎儿和母体都存在不同程度的创伤性和风险，为克服这一难题，从20世纪90年代末，人们开始探索一种无创伤性的产前诊断方法，即利用妊娠期少量胎儿细胞可以通过胎盘进入母体血液中这一现象，采用流式细胞仪分离、磁激活细胞分选、免疫磁珠法、显微操作分选法及分子细胞遗传学技术等，分离和分析胎儿有核细胞及血清中游离的胎儿DNA或RNA，从而进行无创性基因诊断。显然，这一方法是产前诊断的未来发展方向。但是，能够富集的胎儿细胞及血清中游离的胎儿DNA或RNA含量相对较少，成为本技术的最大发展障碍。

（三）植入前诊断

随着人工授精、试管婴儿和胚胎移植的开展，以及单个细胞基因诊断技术的应用，胚胎植入前遗传学诊断（pre－implantation genetic diagnosis，PGD）日趋成熟。PGD技术是指在体外受精的胚胎，发育到4～8细胞期，通过显微操作技术取出单个卵裂球细胞，应用PCR、FISH等技术进行快速的遗传学分析，包括染色体检查、特定基因检测、性别鉴定，正常的胚胎再植入母体子宫。PGD技术能将产前诊断时限提早到胚胎植入之前，从源头上阻断了遗传病的传递，避免了产前诊断可能引起出血、流产和感染及伦理问题，从而将避免人类遗传缺陷的发生掌控在最早阶段，故是遗传病产前诊断的重大突破。

三、基因诊断

利用分子生物学技术，检测DNA、RNA结构或基因表达水平变化，从而对疾病做出诊断的方法，称为基因诊断（gene diagnosis）。1978年，华裔美国学者简悦威（Yuet－Wai Kan）首次采用DNA重组技术对血红蛋白病进行产前诊断，开创了“基因诊断”的先河。目前，基因诊断早已进入欧美各国的临床应用，不仅针对遗传性疾病，而且用于对一些感染性疾病和肿瘤的诊断。

基因诊断具有以下特点：以特定基因为目标，检测基因的突变和表达信息，特异性强；采用分子杂交技术和PCR技术所具有信号放大作用，微量样品即可进行诊断，灵敏度高；可用于尚未出现临床表现前，胎儿的出生前诊断、群体筛查等，应用广泛；检测样品获得便利，不受个体发育阶段性和基因表达组织特异性的限制。

需要说明的是，由于基因突变的类型多种多样，除了缺失、倒位、点突变、动态突变可以进行基因的检测外，大多数基因突变的分析复杂而繁琐，有一定的难度。

（一）基因诊断的主要方法

基因诊断主要采用核酸分子杂交、PCR和DNA测序等技术。

1.核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是检测样品中是否存在相应的基因及相应基因的表达状态等。其中，Southern印迹法主要用于基因组DNA的分析，Northern印迹法用于检测样品中RNA的种类和含量。

（1）斑点印迹杂交：把待检测的核酸样品点在尼龙膜上，变性后与标记的探针进行结合反应，经过显色和显影后检测杂交信号的强度，与对照比较后确定所测核酸量的高低。根据尼龙膜上所点核酸样品的种类不同，分为DNA斑点印迹杂交和RNA斑点印迹杂交。

（2）原位杂交：把组织或细胞样品经过适当处理，用探针与核酸进行杂交。这种方法不需要提取核酸，可以确定被检核酸在组织或细胞及中期染色体上的定位，具有重要的生物学和病理学意义。

（3）PCR－ASO：等位基因特异性寡核苷酸杂交法（allele－specific oligonucleotide，ASO）是核酸杂交的一种方法。PCR－ASO是将PCR与ASO方法结合的一种检测技术。根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备与野生型或突变型基因序列互补的2种探针，分别与被检测者样品中的DNA分子进行杂交，根据样品与2种探针杂交信号的强弱，确定是否存在基因突变，判断被检者是突变基因的纯合体或杂合体（图16－3）。

（4）基因芯片（gene chip）技术：是近年来发展迅速的大规模、高通量分子检测技术。基本过程是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，如玻片、硅片或尼龙膜等，形成矩阵点。样品DNA／RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后与待测样本进行杂交反应，再通过激光共聚焦荧光显微镜对芯片进行扫描，经计算机系统分析处理所得资料，对上千种甚至更多基因的表达水平、突变和多态性进行快速、准确的检测。

图16－3 ASO探针杂交原理示意图

基因芯片可以进行微量化、大规模、并行化、高度自动化地处理有价值的生物样品，精细地研究各种状态下分子结构变异，了解组织细胞基因表达情况。既可检测基因的多态性，又能检测基因突变，特别适用于多个基因、多个位点的同时检测。这一技术目前处于发展和优化阶段，已经有多种针对遗传性疾病、肿瘤检测的基因芯片用于临床诊断。

2.DNA测序技术 此技术对人体基因组和转录组进行测序是了解人类疾病遗传基础和开展基因诊断最直接、最有效的方法。早期的DNA测序（DNA sequencing）技术由英国科学家Frederick Sanger和美国科学家Walter Gilbert发明。这种DNA测序技术可以对特定DNA片段进行精确分析。第2代DNA测序技术（the next－generation DNA sequencing）在人类基因组计划实施中诞生。这一技术可以在较短时间内完成大规模的核酸序列分析，使得全基因组、全外显子组和全转录组分析在临床诊断中的应用变为现实。近年来，单分子等第3代测序技术也开始兴起，使得测序技术向着碱基序列更长、精度更高、通量更大、时间更短、成本更低等方向发展。

（二）其他常用的技术

1.PCR－RFLP 此法是指将PCR与RFLP方法结合的一种检测技术。由于DNA序列的差异，造成了内切酶位点的变化，或是新酶切位点的产生，或是原酶切位点的消失等。通过酶切后电泳图谱的判断，确定检测结果。该方法包括：①PCR：利用1对或数对特异性引物，将目标DNA扩增；②酶切：利用某些限制性内切酶消化PCR产物，如PCR产物中含有相应的酶切位点序列，DNA链则被切开；③利用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶分离酶切后的PCR产物，根据电泳图谱判断结果。

图16－4 SSCP原理示意图

如果某DNA序列已经全部确定，则可以通过计算机辅助设计特异性PCR引物；扩增DNA片段和进行酶切位点分析。该方法简便易行，精确度也很高。但是该方法也有一定的局限性，如果多态性位点的DNA序列没有相应的内切酶，则该方法不适用。

2.PCR－SSCP 该方法与PCR联合应用，故称PCR－SSCP，主要用于突变分子的初步筛查。单链构象多态性（single－strand conformation polymorphism，SSCP）是一种检测核酸序列中点突变的技术。当双链DNA变性为2条单链后，会在中性条件下形成各自特定的空间构象，因而在电泳时将在不同的位置上出现不同的电泳条带。如果DNA序列发生改变，甚至仅有1个碱基变化时，空间构象有可能发生改变，电泳时表现出不同的迁移率，被检DNA电泳条带与已知序列的对照DNA电泳条带不一致，出现新生条带时，表明有突变存在（图16－4）。

3.反转录聚合酶链反应（RT－PCR） 此技术是指以mRNA为模板合成c DNA，再进行PCR，用于基因表达水平的检测和分析。

4.DHPLC 此技术即为变性高效液相色谱分析（denaturing high－performance liquid chromatography，DHPLC）几乎为每一个基因诊断室所必备。DHPLC用于DNA序列变异的检测，其本质上是用离子对反相HPLC进行DNA杂合双链片段分析。假定突变类型为单个碱基的替代突变，其检测原理如下：当野生型DNA片段（Wt Wt′，分别表示正义链和反义链）和突变型DNA片段（Mu Mu′，分别表示正义链和反义链）等量混合（若为杂合突变，PCR产物中既包含野生型，又包含突变型DNA片段），95℃加热使之完全变性后缓慢冷却、复性，形成4种DNA片段：Wt Wt′，Mu Mu′，Wt Mu′和Mu Wt′。前2种为纯合双链DNA片段，后2种为杂合双链DNA片段。这4种DNA片段在非变性温度下（如50℃）洗脱时仅表现出单峰。但是，当洗脱温度升高时，纯合双链和杂合双链DNA片段部分解链，由于杂合双链DNA片段在突变位点有不配对的碱基（错配碱基），它们的部分解链程度要大于纯合双链DNA片段，相应地与基质颗粒的结合作用小，在基质中的滞留时间短。这样，DHPLC就可以依据杂合双链和纯合双链DNA片段滞留时间的不同，将它们区分开。在理想状态下， DHPLC的洗脱图中可出现4个峰，先洗脱的2个峰各自代表2种杂合双链DNA片段中的1种，后洗脱的2个峰分别代表2种纯合双链DNA片段中的1种。因此，仅从样本DHPLC洗脱峰型的变化，可以判断样本是否存在突变。

5.Western印迹法 Western印迹技术是检测特定蛋白质的方法，可用于某种与遗传病相关的蛋白质定性定量分析。如假肥大型肌营养不良（DMD）患者基因缺陷使肌细胞的抗肌萎缩蛋白（dystrophin）合成异常，采用Western印迹法可对患者的抗肌萎缩蛋白进行检测。

（三）基因诊断技术的应用

1.基因诊断在遗传病中的应用

（1）镰状细胞贫血的基因诊断：镰状细胞贫血症的基因突变发生在β珠蛋白基因内部，可以用限制性内切酶MstⅡ进行检测。基于编码β珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，改变了限制性内切酶MstⅡ的酶切位点。正常人DNA和患者DNA经MstⅡ酶切后，用标记的β珠蛋白基因为探针做Southern杂交时，就会出现不同的DNA条带。MstⅡ的切割序列是CCTNAGG，切割正常人DNA产生1.15kb DNA片段；切割患者DNA产生1.35kb DNA片段，杂合子则形成1.15和1.35kb两个片段。

（2）血友病A的基因诊断：血友病A呈X连锁隐性遗传，为因遗传性凝血障碍所致的出血性疾病，由于凝血因子Ⅷ（FactorⅧ，FⅧ）基因缺陷占95％，基因重排（如缺失、插入和重复）仅占5％。突变类型为碱基替换、缺失和插入，这些突变产物可能是不完整的、无活性的或不稳定的因子Ⅷ肽链，导致临床症状轻重不一。采用基因诊断可以检出有部分基因缺失的患者和女性携带者，还可进行产前检查。对该基因的产前诊断可以通过限制性（内切酶）片段长度多态性（RFLP）连锁分析进行，在基因的内侧及旁侧有多组RFLP位点供基因诊断。

（3）α地中海贫血的基因诊断：α地中海贫血是由于α珠蛋白基因缺失造成的。α链是由2对基因控制的，如果1条16号染色体上的2个α基因都缺失，称为α0地中海贫血；如果1条16号染色体上的2个基因缺失1个，称为α＋地中海贫血。这2种α地中海贫血基因可以组合引起不同的α地中海贫血综合征。在目标基因的两端设计引物，扩增后进行琼脂糖电泳，可以检测缺失突变，确定受检者的基因型，对可疑的胎儿进行产前诊断。

2.基因诊断在肿瘤中的应用 肿瘤发生和发展是一个多因素、多步骤过程，涉及多个癌基因的结构改变和表达异常，如抑癌基因的缺失和突变等。基因诊断除了用于肿瘤的早期诊断外，还可以对肿瘤进行临床分类、预后判断，对肿瘤高危人群进行筛选，指导个体化治疗和预防。

（1）肺癌：近年来对肺癌的细胞遗传学研究表明，肺癌发生时常涉及1，2，3，5，6，9，11， 13，17号染色体的缺失或易位，ras、myc、erb和src癌基因的扩增、突变，以及抑癌基因Rb、TP53的突变或缺失，应用PCR－ASO、PCR－SSCP及FISH，可以检测其基因突变或缺失。肺癌患者常存在ras、myc、erb和src癌基因的过表达，因此可采用Northern印迹方法进行RNA检测与分析，在基因水平诊断肺癌。

（2）乳腺癌：乳腺癌是女性常见肿瘤之一。BRCA1基因是一种肿瘤抑制基因，编码一种核蛋白，具有维持基因组稳定性的功能。它与其他肿瘤抑制因子和信号传感器等组成复合物，在基因转录、DNA损伤修复及重组中扮演重要作用。该基因的突变使个体患乳腺癌的风险大大增加，通过基因芯片技术可对该基因的突变进行检测。此外，癌基因Nue与乳腺癌的发生和预后密切相关，表达产物为表皮生长因子（EGF）样受体，属于受体型酪氨酸蛋白激酶（TPK）家族成员。有Nue基因扩增的患者复发和转移率高，可作为乳腺癌预后的一项重要指标。采用Southern印迹法，可以检测Nue基因的拷贝数；Northern印迹方法检测Nue基因表达水平，进行定量分析。

（3）大肠癌：在肠癌癌变的过程中存在抑癌基因家族性多发性腺瘤病（family adenomatous polyposis，FAP）、DCC、TP53基因的丢失，TP53基因的突变；癌基因K－ras的点突变、C－myc的过表达等现象。

ras基因突变的检测可采用PCR－ASO方法进行，已知ras基因突变的热点在12、13及61密码子，可人工合成位于待测点两侧的引物，分别扩增含12、13及61位点的基因片段，将扩增产物结合在核衣壳（NC）膜上分别与相应的碱基突变特异性寡核苷酸探针杂交，检测突变类型。还可以采用PCR－DHPLC方法，对ras基因突变进行初筛，再通过DNA测序检测点突变，此方法简便、准确。

TP53基因的缺失、突变、失活是许多肿瘤发生的原因，这些肿瘤包括成骨肉瘤、肺癌、结（直）肠癌、神经纤维肉瘤、脑瘤、乳腺癌等。该基因的突变可引起蛋白质功能的突变，导致细胞恶性转化。PCR法进行检测TP53突变热点外显子5～8，先扩增外显子5～8，再进行突变位点的详尽分析，采用PCR－DHPLC方法，然后测序，检测TP53基因的突变。