灭菌与无菌操作

一、基本概念

灭菌是注射剂生产中的重要过程，灭菌法是杀死或去除所有微生物的方法。微生物包括细菌、真菌、病毒等。细菌的芽孢具有较强的耐热力，所以灭菌效果以杀死芽孢为准。药物制剂生产中的灭菌方法，要求达到灭菌的目的，符合《中国药典》的相关要求，并且必须保持药物稳定。常用的药物制剂灭菌法如图4－2所示。

图4－2 常用的药物制剂灭菌法

1．灭菌和灭菌法

（1）灭菌：系指用物理或化学等方法杀灭或除去所有致病和非致病微生物繁殖体和芽胞的手段。

（2）灭菌法：系指杀灭或除去所有致病和非致病微生物繁殖体和芽胞的方法或技术。

2．无菌和无菌操作法

（1）无菌：系指在任一指定物体、介质或环境中，不得存在任何活的微生物。

（2）无菌操作法：系指在整个操作过程中利用或控制一定条件，使产品避免被微生物污染的一种操作方法或技术。

3．防腐和消毒

（1）防腐：系指用物理或化学方法抑制微生物的生长与繁殖的手段，亦称抑菌。对微生物的生长与繁殖具有抑制作用的物质称抑菌剂或防腐剂。

（2）消毒：系指用物理或化学方法杀灭或除去病原微生物的手段。对病原微生物具有杀灭或除去作用的物质称消毒剂。

采用灭菌与无菌技术的主要目的是：杀灭或除去所有微生物繁殖体和芽胞，最大限度地提高药物制剂的安全性，保护制剂的稳定性，保证制剂的临床疗效。因此，研究、选择有效的灭菌方法，对保证产品质量具有重要意义。

二、物理灭菌技术

利用蛋白质与核酸具有遇热、射线不稳定的特性，采用加热、射线和过滤方法，杀灭或除去微生物的技术称为物理灭菌法，亦称物理灭菌技术。该技术包括干热灭菌、湿热灭菌、过滤灭菌法和射线灭菌。

1．干热灭菌法　本法系指在干燥高温环境中进行灭菌的技术，其中包括火焰灭菌法和干热空气灭菌法。

（1）火焰灭菌法：本法系指用火焰直接灼烧灭菌的方法。该法灭菌迅速、可靠、简便，适用于耐火焰材质（如金属、玻璃及瓷器等）的物品与用具的灭菌，不适合药品的灭菌。

（2）干热空气灭菌法：本法系指用高温干热空气灭菌的方法。该法适用于耐高温的玻璃和金属制品以及不允许湿气穿透的油脂类（如油性软膏基质、注射用油等）和耐高温的粉末化学药品的灭菌，不适于橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。

在干燥状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强，必须长时间受高热作用才能达到灭菌的目的。因此，干热空气灭菌法采用的温度一般比湿热灭菌法高。为了确保灭菌效果，一般规定为：135～145℃灭菌3～5h；160～170℃灭菌2～4h；180～200℃灭菌0．5～1h。

2．湿热灭菌法　本法系指用饱和蒸气、沸水或流通蒸气进行灭菌的方法。由于蒸气潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，因此该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的方法。湿热灭菌法可分类为：热压灭菌法、流通蒸气灭菌法、煮沸灭菌法和低温间歇灭菌法。

（1）热压灭菌法：本法系指用高压饱和水蒸气加热杀灭微生物的方法。该法具有很强的灭菌效果，灭菌可靠，能杀灭所有细菌繁殖体和芽胞，适用于耐高温和耐高压蒸汽的所有药物制剂，玻璃容器、金属容器、瓷器、橡胶塞、滤膜过滤器等。

在一般情况下，热压灭菌法所需的温度（蒸汽表压）与时间的关系为：115℃（67k Pa）， 30min；121℃（97k Pa），20min；126℃（139k Pa），15min。在特殊情况下，可通过实验确认合适的灭菌温度和时间。

（2）流通蒸气灭菌法：本法系指在常压下，采用100℃流通蒸气加热杀灭微生物的方法。灭菌时间通常为30～60min。该法适用于消毒及不耐高热制剂的灭菌。但不能保证杀灭所有的芽胞，是非可靠的灭菌法。

（3）煮沸灭菌法：系指将待灭菌物置沸水中加热灭菌的方法。煮沸时间通常为30～60min。该法灭菌效果较差，常用于注射器、注射针等器皿的消毒。必要时可加入适量的抑菌剂，如三氯叔丁醇、甲酚、氯甲酚等，以提高灭菌效果。

（4）低温间歇灭菌法：系指将待灭菌物置60～80℃的水或流通蒸气中加热60min，杀灭微生物繁殖体后，在室温条件下放置24h，让待灭菌物中的芽胞发育成繁殖体，再次加热灭菌、放置，反复多次，直至杀灭所有芽胞。该法适合于不耐高温、热敏感物料和制剂的灭菌。其缺点是费时、工效低、灭菌效果差，加入适量抑菌剂可提高灭菌效率。

3．滤过灭菌法　本法系指采用过滤法除去微生物的方法。该法属于机械除菌方法，该机械称为除菌过滤器。

该法适合于对热不稳定的药物溶液、气体、水等物品的灭菌。灭菌用过滤器应有较高的过滤效率，能有效地除尽物料中的微生物，滤材与滤液中的成分不发生相互交换，滤器易清洗，操作方便等。

为了有效地除尽微生物，滤器孔径必须小于芽胞体积（＞0．5μm）。常用的除菌过滤器有：0．22μm或0．3μm的微孔滤膜滤器和G6（号）垂熔玻璃滤器。过滤灭菌应在无菌条件下进行操作，为了保证产品的无菌，必须对过滤过程进行无菌检测。

4．射线灭菌法　本法系指采用辐射、微波和紫外线杀灭微生物和芽胞的方法。

（1）辐射灭菌法：系指采用放射性同位素（60 Co和137Cs）放射的γ射线杀灭微生物和芽胞的方法，辐射灭菌剂量一般为2．5×104Gy（戈瑞）。该法已被《英国药典》和《日本药局方》收载。

本法适合于热敏物料和制剂的灭菌，常用于维生素、抗生素、激素、生物制品、中药材和中药制剂、医疗器械、药用包装材料及药用高分子材料等物质的灭菌。其特点是：不升高产品温度，穿透力强，灭菌效率高；但设备费用较高，对操作人员存在潜在的危险性，对某些药物（特别是溶液型）可能产生药效降低或产生毒性物质和发热物质等。

（2）微波灭菌法：采用微波（频率为300m Hz～300km Hz）照射产生的热能杀灭微生物和芽胞的方法。

该法适合液态和固体物料的灭菌，且对固体物料具有干燥作用。其特点是：微波能穿透到介质和物料的深部，可使介质和物料表里一致地加热；且具有低温、常压、高效、快速（一般为2～3min）、低能耗、无污染、易操作、易维护、产品保质期长（可延长1／3以上）等特点。

（3）紫外线灭菌法：系指用紫外线（能量）照射杀灭微生物和芽胞的方法。用于紫外灭菌的波长一般为200～300nm，灭菌力最强的波长为254nm。该方法属于表面灭菌。

紫外线不仅能使核酸蛋白变性，而且能使空气中氧气产生微量臭氧，而达到共同杀菌作用。该法适合于照射物表面灭菌、无菌室空气及蒸馏水的灭菌；不适合于药液的灭菌及固体物料深部的灭菌。由于紫外线是以直线传播，可被不同的表面反射或吸收，穿透力微弱，普通玻璃即可吸收紫外线，因此装于容器中的药物不能用紫外线灭菌。紫外线对人体有害，照射过久易发生结膜炎、红斑及皮肤烧灼等伤害，故一般在操作前开启1～2h，操作时关闭；必须在操作过程中照射时，对操作者的皮肤和眼睛应采用适当的防护措施。

三、化学灭菌法

化学灭菌法系指用化学药品直接作用于微生物而将其杀灭的方法。

对微生物具有触杀作用的化学药品称杀菌剂，可分为气体杀菌剂和液体杀菌剂。杀菌剂仅对微生物繁殖体有效，不能杀灭芽胞。化学杀菌剂的杀灭效果主要取决于微生物的种类与数量、物体表面光洁度或多孔性以及杀菌剂的性质等。化学灭菌的目的在于减少微生物的数目，以控制一定的无菌状态。

1．气体灭菌法 系指采用气态杀菌剂（如环氧乙烷、甲醛、丙二醇、甘油和过氧乙酸蒸气等）进行灭菌的方法。该法特别适合环境消毒以及不耐加热灭菌的医用器具、设备和设施等的消毒，亦用于粉末注射剂，不适合对产品质量有损害的场合。同时应注意残留的杀菌剂和与药物可能发生的相互作用。

2．药液灭菌法 系指采用杀菌剂溶液进行灭菌的方法。该法常应用于其他灭菌法的辅助措施，适合于皮肤、无菌器具和设备的消毒。常用消毒液有：75％乙醇、1％聚维酮碘溶液、0．1％～0．2％苯扎溴铵（新洁尔灭）溶液、酚或煤酚皂溶液等。

四、无菌操作法

无菌操作法系指整个过程控制在无菌条件下进行的一种操作方法。该法适合一些不耐热药物的注射剂、眼用制剂、皮试液、海绵剂和创伤制剂的制备。按无菌操作法制备的产品，一般不再灭菌，但某些特殊（耐热）品种亦可进行再灭菌（如青霉素G等）。最终采用灭菌的产品，其生产过程一般采用避菌操作（尽量避免微生物污染），如大部分注射剂的制备等。

1．无菌操作室的灭菌　常采用紫外线、液体和气体灭菌法对无菌操作室环境进行灭菌。

（1）甲醛溶液加热熏蒸法：该方法的灭菌较彻底，是常用的方法之一。气体发生装置可采用蒸气加热夹层锅，使液态甲醛汽化成甲醛蒸气，经蒸气出口送入总进风道，由鼓风机吹入无菌室，连续3h后，关闭密熏12～24h，并应保持室内湿度＞60％，温度＞25℃，以免低温导致甲醛蒸气聚合而附着于冷表面，从而降低空气中甲醛浓度，影响灭菌效率。密熏完毕后，将25％的氨水经加热，按一定流量送入无菌室内，以清除甲醛蒸气，然后开启排风设备，并通入无菌空气直至室内排尽甲醛。

（2）紫外线灭菌：该方法是无菌室灭菌的常规方法，应用于间歇和连续操作过程中。一般在每天工作前开启紫外灯1h左右，操作间歇中亦应开启0．5～1h，必要时可在操作过程中开启（应注意操作人员眼、皮肤等的保护）。

（3）液体灭菌：这是无菌室较常用的辅助灭菌方法，主要采用3％酚溶液、2％煤皂酚溶液、0．2％苯扎溴铵或75％乙醇喷洒或擦拭，用于无菌室的空间、墙壁、地面、用具等方面的灭菌。

2．无菌操作　无菌操作室、层流洁净工作台和无菌操作柜是无菌操作的主要场所，无菌操作所用的一切物品、器具及环境，均需按前述灭菌法灭菌，如安瓿应150～180℃、2～3h干热灭菌，橡皮塞应121℃、1h热压灭菌等。操作人员进入无菌操作室前应洗澡，并更换已灭菌的工作服和清洁的鞋子，不得外露头发和内衣，以免污染。

小量无菌制剂的制备，普遍采用层流洁净工作台进行无菌操作，该设备具有良好的无菌环境，使用方便，效果可靠。无菌操作柜目前常用于药品的试制阶段。

案例——想一想

上海某医院在临床上使用某药物给患者进行静脉滴注时，患者在0．5h左右出现冷颤、高热、出汗、呕吐等症状，体温达40℃，并出现休克症状。经调查表明，患者出现这些症状是因所用注射液含有热原所致。

【问题】 什么是热原？热原的组成是什么？热原致热的主要成分是什么？

四、热原

（一）定义

注射后能引起人体特殊致热反应的物质，称为热原。大多数细菌都能产生热原，致热能力最强的是革兰阴性杆菌，真菌，甚至病毒也能产生热原。热原是微生物的一种内毒素，存在于细菌的细胞膜和固体膜之间，是磷脂、脂多糖和蛋白质的复合物。其中脂多糖是内毒素的主要成分，因而大致可认为热原＝内毒素＝脂多糖。脂多糖组成因菌种不同而不同。热原的相对分子质量一般为1×106左右。

含有热原的注射液注入体内后，大约半小时就能产生发冷、寒战、体温升高、恶心呕吐等不良反应，严重者出现昏迷、虚脱，甚至有生命危险。有人认为细菌性热原自身并不引起发热，而是由于热原进入体内后使体内多形性核白细胞及其他细胞释放一种内源性热原，作用于视丘下部体温调节中枢，可能引起5－羟色胺的升高而导致发热。

（二）热原的性质

1．耐热性　热原在60℃加热1h不受影响，100℃加热也不降解，但在250℃，30～45min，200℃，60min或180℃，3～4h可使热原彻底破坏。在通常注射剂的热压灭菌法中热原不易被破坏。

2．过滤性　热原体积小，为1～5nm，一般的滤器均可通过，即使微孔滤膜，也不能截留，但可被活性炭吸附。

3．水溶性　由于磷脂结构上连接有多糖，所以热原能溶于水。

4．不挥发性　热原本身不挥发，但在蒸馏时，可随水蒸气中的雾滴带入蒸馏水，故应设法防止。

5．其他　热原能被强酸强碱破坏，也能被强氧化剂，如高锰酸钾或过氧化氢等破坏，超声波及某些表面活性剂（如去氧胆酸钠）也能使之失活。

（三）热原的主要污染途径

1．注射用水　注射用水是热原污染的主要来源。尽管水本身并非是微生物良好的培养基，但易被空气或含尘空气中的微生物污染。若蒸馏设备结构不合理，操作与接收容器不当，贮藏时间过长易发生热原污染问题。故注射用水应新鲜使用，蒸馏器质量要好，环境应洁净。

2．原辅料　原辅料特别是用生物方法制造的药物和辅料易滋生微生物，如右旋糖苷、水解蛋白或抗生素等药物，葡萄糖、乳糖等辅料，在贮藏过程中因包装损坏而易污染。

3．容器、用具、管道与设备等　这些设备如未按GMP要求认真清洗处理，常易导致热原污染。

4．制备过程与生产环境　制备过程中室内卫生差，操作时间过长，产品灭菌不及时或不合格，均增加细菌污染的机会，从而可能产生热原。

5．输液器具　有时输液本身不含热原，而往往由于输液器具（输液瓶、乳胶管、针头与针筒等）污染而引起热原反应。

（四）热原的去除方法

1．高温法　凡能经受高温加热处理的容器与用具，如针头、针筒或其他玻璃器皿，在洗净后，于250℃加热30min以上，可破坏热原。

2．酸碱法　玻璃容器、用具用重铬酸钾硫酸清洗液或稀氢氧化钠液处理，可将热原破坏。热原亦能被强氧化剂破坏。

3．吸附法　注射液常用优质针剂用活性炭处理，用量为0．05％～0．5％（w／V）。此外，将0．2％活性炭与0．2％硅藻土合用于处理20％甘露醇注射液，除热原效果较好。

4．离子交换法　国内有用＃301弱碱性阴离子交换树脂10％与＃122弱酸性阳离子交换树脂8％成功地除去丙种胎盘球蛋白注射液中的热原的报道。

5．凝胶过滤法　用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶（分子筛）制备无热原去离子水。

6．反渗透法　用反渗透法通过三醋酸纤维膜除去热原，这是近几年发展起来的有使用价值的新方法。

7．超滤法　一般用3．0～15nm超滤膜除去热原。如超滤膜过滤10％～15％的葡萄糖注射液可除去热原。Sulliven等采用超滤法除去β－内酰胺类抗生素中内毒素等。

8．其他方法　采用二次以上湿热灭菌法，或适当提高灭菌温度和时间，处理含有热原的葡萄糖或甘露醇注射液亦能得到热原合格的产品。微波也可破坏热原。

课堂讨论

在注射剂的生产过程中，为了避免热原的产生，可以采取的措施有哪些？

知识拓展

灭 菌 参 数

近年来对灭菌过程无菌检验中存在的问题引起人们的注意。一方面灭菌温度多系测量灭菌器内的温度不是灭菌物体内的温度，同时无菌检验方法也存在局限性。在检品存在微量的微生物时，往往难以用现行的无菌检验法检出。因此，人们对认识到对灭菌方法的可靠性进行验证是很必要的。F（或F0）值可作用验证灭菌可靠性的参数。

1．D值 在一定温度下，杀灭90％微生物（或残存率为10％）所需的灭菌时间。杀灭微生物符合一级动力学过程，即：

式中：Nt为灭菌时间为t时残存的微生物数；N0为原有微生物数；k为灭菌常数。

由此可知，D值即为降低被灭菌物品中微生物数至原来的1／10或降低一个对数单位（如lg 100降低至lg 10）所需的时间，即lg N0－lg Nt＝lg 100－lg 10＝1时的t值。

2．Z值 降低一个lg D值所需升高的温度，即灭菌时间减少到原来的1／10所需升高的温度或在相同灭菌时间内，杀灭99％的微生物所需提高的温度。

即：

设：Z＝10℃，T1＝110℃，T2＝121℃，按式4－6计算可得：D2＝0．079D1，即110℃灭菌1min与121℃灭菌0．079min的灭菌效果相当。

3．F值

在一定灭菌温度（T）下给定的Z值所产生的灭菌效果与在参比温度（T0）下给定的Z值所产生的灭菌效果相同时所相当的时间（equivalent time）。F值常用于干热灭菌，以min为单位，其数学表达式为：

4．F0值

在一定灭菌温度（T），Z值为10℃所产生的灭菌效果与121℃，Z值为10℃所产生的灭菌效果相同时所相当的时间（min）。F0值目前仅限于热压灭菌。物理F0值的数学表达式为：

根据式4－8，在灭菌过程中，仅需记录被灭菌物的温度与时间，即可计算F0值。由于F0值是将不同灭菌温度计算到相当于121℃热压灭菌时的灭菌效力，故F0值可作为灭菌过程的比较参数，对灭菌过程的设计及验证灭菌效果极为有用。鉴于F0值体现了灭菌温度与时间对灭菌效果的统一，该数值更为精确、实用。

计算、设置F0值时，应适当考虑增加安全系数，一般增加理论值的50％，即规定F0值为8min，实际操作应控制在12min。

案例——做一做

试比较干热灭菌法中火焰灭菌法和干热空气灭菌法的异同点？按表4－3的形式区分辐射灭菌法、紫外线灭菌法和微波灭菌法。

表4－3 各种灭菌法的比较