免疫球蛋白基因重排

(一)人免疫球蛋白胚系基因结构

免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)的基本结构是四肽链,由两条完全相同的重链和两条完全相同的轻链组成。重链分为5类:μ链、γ链、α链、δ链和ε链;轻链有κ链和λ链两型。编码人κ和λ轻链的基因群分别位于第2号染色体和第22号染色体。如图6-1所示,免疫球蛋白κ链基因群由34～38个Vκ和5个Jκ基因片段组成可变区基因,以及1个Cκ恒定区基因组成。免疫球蛋白λ链可变区基因由29～33个Vλ和4～5个Jλ基因片段组成。免疫球蛋白λ链恒定区基因由4～5个Cλ基因片段组成。编码免疫球蛋白λ链的基因群,其排列顺序和κ轻链有所不同。在成簇排列的Vλ基因片段之后,是交错排列的Jλ和Cλ基因片段。编码人免疫球蛋白重链的基因群位于第14号染色体。免疫球蛋白重链可变区基因分别由38～46个VH、23个DH和6个JH基因片段间断排列组成;免疫球蛋白重链恒定区基因由9个CH基因片段组成。每个CH基因片段对应不同的免疫球蛋白同种型(isotype)。通过对mRNA前体选择性剪切,初始B细胞(naive B cell)最初表达的Ig同种型是μ和δ,产生IgM和IgD。活化的B细胞通过类别转换机制表达其他的重链同种型,例如γ,产生IgG。

免疫球蛋白胚系基因,以成簇的可变区V、(D)和J基因节段的不连续间断排列为特点,虽可见于包括B细胞在内的所有体细胞,但并不具备转录活性。只有B细胞在骨髓的特定发育阶段,启动免疫球蛋白可变区基因重排,在这些成簇的基因片段中选择某些基因片段重新组合,形成连续、完整的单个可变区V(D)J基因,才具备转录活性(图6-1)。

图6-1 人Ig重链和轻链胚系基因结构

(二)Ig基因重排及机制

1.完整VL基因的产生 图6-2(1)显示从间断排列的V和J基因节段中随机选择一个片段重排,形成连续完整VJ外显子(exon),编码轻链可变区(variable region,V区)。同时,V和J基因片段的组合,会缩短可变区与恒定区(constant region,C区)基因节段间的距离,但两者之间仍然间隔JC内含子(intron)。转录后通过对初级m RNA转录物的剪接,去除内含子使V区VJ外显子和C区的外显子相连。成熟mRNA翻译合成完整的Ig轻链。

2.完整VH基因的产生 图6-2(2)显示间断排列的V、D和J基因片段随机组合,产生完整的Ig重链可变区(VH)基因,编码Ig重链可变区的过程。整个过程分为两个阶段。首先,一个DH基因片段和一个JH片段组合;然后,一个VH基因片段和重组DJH构成一个完整的VH基因外显子。与轻链可变区基因重排过程相似,通过对初级mRNA转录物进行剪接等转录后加工,成熟mRNA翻译合成完整的Ig重链。

图6-2 轻链和重链可变区基因重排

3.重组信号序列和12/23规则 一些位于Ig和TCR可变区基因片段外显子旁侧、与可变区基因片段重排有关的DNA序列,称为重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。图6-3(1)显示RSS的基本结构组成和位置。RSS包括一个高度保守的、具有回文结构的7核苷酸序列(heptamer,CACAGTG);一个高度保守的、富含A(腺嘌呤核苷)的9核苷酸序列(nonamer,ACAAAAACC);以及两者之间、非保守的12或23碱基对(bp)间隔序列(spacer)。RSS7核苷酸序列,总是紧邻V、D和J基因的外显子。可变区基因片段之间的重排往往发生于同一条染色体,遵循12/23规则(12/23rule),即一侧为12bp间隔序列RSS的基因片段,只能与一侧为23bp间隔序列RSS的基因片段进行组合。对于重链而言, 23bp间隔序列RSS位于众多V基因片段3'端和J基因片段5'端,D基因片段两侧是12bp间隔序列RSS。因此,重链V与J基因片段之间无法直接组合。

4.V(D)J重组酶和连接多样性 参与Ig和TCR基因重组的酶统称为V(D)J重组酶。重组激活基因1和2(recombination activating gene,)Rag1和Rag2编码的激活重组酶RAG-1/RAG-2复合物,仅在淋巴细胞发育过程中的TCR或BCR基因重排阶段特异性表达,在基因重排中发挥主要作用。RAG作为核酸内切酶,能够特异性识别、排列靠拢和切除位于两个待重排基因片段编码序列旁侧的RSS,并引起双链DNA断裂。图6-3(2)以VL和JL片段重排为例,其RSS分别位于VL3'端(7核苷酸序列-12bp-9核苷酸序列)和JL5'端(9核苷酸序列-23bp-7核苷酸序列)的内含子区域。因为相对应的RSS7核苷酸序列或9核苷酸序列是反向互补序列,在HMG-1和HMG-2(DNA bending and looping high mobility group-1 and group-2)作用下,位于VL和JL片段外显子中间的DNA形成茎-环状结构(stem and loop structure),造成VL和JL片断相互靠拢。RAG作用在RSS和VL或JL编码序列的交界处,产生VL和JL双链DNA断端。VL和JL编码端,分别形成“U”形发夹结构(hairpin)。在Artemis核酸酶等作用下,发夹被打开,形成单链回文结构(palindrome)(图6-4)。在连接不同基因片段时,核苷酸的插入和丢失会产生新的核苷酸编码序列,有按照单链回文结构模板添加的P-核苷酸序列(P-nucleotide,该序列存在于原先发夹部位互补的双链DNA中),以及末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)添加的非模板编码N-核苷酸序列(N-nucleotide)。最后,在DNA双链断端损伤修复和修饰蛋白Ku蛋白、DNA连接酶Ⅳ以及XRCC4(X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4)等的作用下完成VL和JL断端连接,形成一个完整的编码免疫球蛋白轻链可变区的VJ外显子(图6-4)。

图6-3 信号重组序列

(三)基因重排产生Ig多样性的机制

基因重排是指将原本间隔排列的不同基因片段,连接成完整的可变区基因外显子,编码Ig和TCR可变区。基因重排通过组合多样性(combinatorial diversity)和连接多样性(junctional diversity)机制,产生TCR和BCR库的多样性。

图6-4 连接多样性

免疫球蛋白可变区基因的重排,是从众多的V、(D)和J基因片段中随机选取,由此形成组合多样性。连接多样性,指进行重排的免疫球蛋白V、(D)、J基因片段切断部位间的连接往往有核苷酸的插入和丢失,包括密码子错位、读码框架移位、N-核苷酸序列和P-核苷酸序列的插入。在上述基础上,组成抗原结合部位的Ig重链与轻链的不同组合,进一步丰富了BCR库的多样性。从理论上推断,组合多样性约1.9×106,再加上连接多样性,估计在成熟的初始B细胞库中,抗原特异性不同的B细胞克隆可达到1011。