基因重排与细胞分化

B细胞在骨髓的发育为抗原非依赖性,分为早期祖B细胞(early pro-B cell)、晚期祖B细胞(late pro-B cell)、大前B细胞(large pre-B cell)、小前B细胞(small pre-B cell),以及未成熟B细胞(immature B cell)阶段。处于不同发育阶段的B前体细胞,其表面的细胞膜分子以及免疫球蛋白基因的重排和表达情况各异,涉及选择和发育检验点等多个严密调控机制,逐渐分化成熟(图6-5)。

(一)骨髓造血诱导微环境

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)主要包括网状细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞。骨髓造血诱导微环境(hematopoietic incluctive microenvironment, HIM)由基质细胞及其分泌的多种造血生长因子(如IL-3、IL-7、SCF等),以及细胞外基质组成。在骨髓造血诱导微环境影响下,骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)经过多能祖细胞(multipotent progenitor cell,MPP)和共同淋巴样祖细胞(common lymphoid progenitor,CLP)阶段,朝B细胞谱系定向分化发育。

图6-5 B细胞的发育成熟阶段示意图

骨髓造血诱导微环境与早期B细胞发生密切相关。IL-7能驱动定向祖B和T细胞增殖,是T和B细胞生存发育的关键细胞因子。基质细胞表达酪氨酸激酶受体FLT3的配体,与多能祖细胞表面的FLT3结合,FLT3信号刺激多能祖细胞表达IL-7受体(IL-7R)。IL-7R由α链和共用γ链(common γ chain,γC)组成。编码IL-7Rα链的基因缺陷会严重影响小鼠B细胞在骨髓的发育。而人类因IL-7R共用γ链缺陷,发生X连锁的重症免疫缺陷病(X-SCID),表现为NK细胞和T细胞发育受阻,但B细胞发育正常,显示IL-7在人体中对淋巴细胞发育的不同作用。其次,B细胞的分化发育受到转录因子的动态调控。FLT3信号能够刺激多能祖细胞表达B细胞定向分化相关转录因子PU.1。PU.1和Ikaros通过调控B细胞谱系转录因子E2A和EBF在pro-B细胞的转录表达,促进B细胞的定向分化。另外,基质细胞与pro-B细胞之间的VCAM-1/VLA-4非特异性黏附,增强基质细胞表面的SCF与pro-B细胞上的酪氨酸激酶受体c-Kit的结合,促进pro-B细胞增殖。

(二)pro-B细胞阶段的Ig重链可变区基因重排

BCR复合物由识别和结合抗原的膜表面免疫球蛋白(mIg)和传递抗原刺激信号的Igα/Igβ(CD79a/CD79b)异二聚体组成。在早期pro-B细胞阶段重链可变区基因D和J片段发生重排;到晚期pro-B细胞阶段重链可变区基因片段VH和DJH发生重排,此时轻链编码基因尚处于胚系基因状态。具有转录活性的重链可变区基因重排成功,合成膜型μ重链。μ链和由Vpre B和λ5组成的替代轻链(surrogate light chain,SLC)以及Igα/Igβ异二聚体组装成pre-B细胞受体(pre-BCR)复合物,表达于细胞表面。pre-BCR信号刺激pro-B细胞增殖进入大前B细胞阶段。

pro-B细胞表达的B细胞谱系分化相关转录因子E2A和EBF,在B细胞发育的初期阶段发挥重要作用。E2A和EBF激活V(D)J重组酶RAG基因的转录表达,启动pro-B细胞重链V(D)J基因重排;其次,E2A和EBF激活pro-B细胞表达转录因子PAX5。PAX5通过调控下游B细胞特异性基因的表达,如替代轻链Vpre B和λ5、pre-BCR和BCR复合物中的信号转导分子Igα,以及B细胞共受体复合物成员CD19基因,对B细胞的定向分化起决定性作用。Pax5缺陷使pro-B细胞向pre-B细胞发育受阻,转而分化为T细胞或髓样细胞。

早期的pro-B细胞,两条染色体可同时进行Ig重链DH和JH基因重排。但进入到pro-B后期阶段,首先在一条染色体上开始VH和DJH重排。一旦重排成功,合成完整的μ链,将会抑制另一条染色体上的重链基因重排(等位排斥),细胞发育为pre-B细胞。一条染色体上VH和DJH重排失败的可能性约为2/3,而在另一条染色体上重新开始的基因重排,同样有2/3的失败可能性。因此,粗略统计产生一个pre-B细胞的概率是55%[1/3+(2/3×1/3)=0.55]。换言之,约有45%的pro-B因不能表达μ链在此阶段被清除。但实际pro-B细胞因重排失败被清除的比例可能会更高,因为V基因片段库中存在无功能的假基因,可以参与重排但无法合成蛋白。

TdT的表达量在pro-B细胞阶段最为丰富,在Ig轻链可变区基因重排的pre-B阶段下调。因此,几乎所有人Ig重链可变区V-D和D-J连接部位编码序列可见N-核苷酸序列插入,而仅有25%的人Ig轻链基因有N-核苷酸序列。TdT在pro-B细胞的表达特异性增高,有助于增加B细胞抗原受体库的多样性。

(三)pre-BCR的表达和B细胞发育检验点

pro-B细胞Ig重链可变区基因重排成功,膜型μ链和替代轻链以及Igα/Igβ异二聚体组成pre-BCR复合物表达于细胞表面,即成为pre-B细胞。

编码替代轻链λ5和Vpre B的基因远离免疫球蛋白基因座位,其表达受转录因子E2A和EBF调控。因与λ轻链C结构域和轻链V结构域的相似性,分别取名λ5和Vpre B。Igα/Igβ异二聚体自pro-B细胞阶段开始,持续表达于各阶段B细胞的表面,是pre-BCR和BCR复合物的组成成分,参与pre-BCR和BCR的信号转导。

pre-BCR的配体不明,但pre-BCR之间通过替代轻链Vpre B和λ5氨基端相互作用,交联成二聚体或多聚体,产生信号。pre-BCR信号会暂时下调RAG表达,从而阻止另一条染色体重链基因重排,避免发生一个B细胞表达两种抗原特异性BCR,即等位排斥(allelic exclusion)。同时,pre-BCR信号增加pro-B细胞对IL-7的敏感性,驱动μ链重排成功的pro-B细胞分裂增殖,pro-B细胞分化为pre-B细胞。如果将pre-BCR复合物中的λ5基因敲除或使重链跨膜结构域缺失突变,会导致B细胞进一步发育受阻,说明pre-BCR表达是检验Ig重链重排成功与否,决定pro-B细胞分化为pre-B的一个重要检验点。

(四)小前B细胞阶段的轻链基因重排

大前B细胞在pre-BCR信号刺激下经过数轮细胞增殖分裂,使表达μ链的细胞数扩增达30～60倍。pre-BCR信号下调λ5和Vpre B基因表达,不再表达替代轻链和pre-BCR的子代细胞,停止增殖,回到静息状态,进入小前B细胞阶段。小前B细胞重新表达基因重组酶RAG,启动轻链的VJ基因重排,重链和轻链结合,细胞表面表达抗原受体膜型IgM,pre-B细胞即成为未成熟B细胞。

一个成功完成重链可变区基因重排的pre-B细胞,首先通过扩增产生大量表达相同μ链的子代细胞;然后启动轻链可变区基因重排,使诸多表达相同μ链的子代细胞得以与不同的轻链进行组合。如此,在细胞层面进一步增加了B细胞抗原受体库的多样性。同样, Ig轻链基因重排存在等位排斥和同型排斥(isotype exclusion,κ轻链基因重排成功后会抑制λ轻链基因重排),以保证一个B细胞克隆表达单一的特异性,以及只表达一种Ig轻链型别。