预防性疫苗的免疫策略

疫苗的接种不是100%有效,任何疫苗都有小部分人低应答或者无应答,但是这不是个严重的问题,如果大多数人都免疫疫苗并具有免疫保护效果,那么这小群低应答或者无应答人群被感染的概率也大大降低,这个现象称为群体免疫力。

疫苗的设计思路总体是这样的:①要明确疫苗激活了哪个免疫系统,区别体液免疫与细胞免疫激活的意义;②要设计可以生产记忆性免疫疫苗,一种疫苗若不能激起记忆性免疫细胞,那么它的保护效果很快会消失。记忆性免疫细胞对不同潜伏期的病毒有不同作用,对于潜伏期较短的病毒如流感病毒(1或2天),有效防治主要通过重复免疫获得中和抗体;对于潜伏期较长的病毒如脊髓灰质炎病毒,需要3天多开始感染中枢神经系统,这个潜伏时间给了记忆性B细胞反应时间,可以产生高水平的抗体。在疫苗免疫后,血清中抗体在2周内水平最高,然后下降,但是记忆性免疫细胞的反应不断攀升,在第6个月达到最高水平和可持续多年(表15-4)。

表15-4 人用疫苗列表

续 表

预防性疫苗的分类见图15-4。

(一)灭活疫苗

制备疫苗的一个常见方法是失活病原体,用热或化学手段使它不再有在宿主中复制的能力但保持表面抗原的结构。热失活一般不理想,因为它会导致大量变性蛋白质;甲醛或各种烷基化灭活剂的化学失活已非常有效应用于人体。索尔克脊髓灰质炎疫苗是由甲醛失活生产的。减毒活疫苗一般只需要一次接种减毒就可以产生持久的免疫力,而灭活疫苗往往需要多次接种维护机体的免疫力。此外,灭活疫苗主要诱导体液免疫应答,它们很少像减毒活疫苗一样能有效诱导细胞免疫应答和使细胞分泌IgA。即使是灭活疫苗也存在风险,如甲醇灭活不彻底的沙克灭活疫苗引发严重并发症,导致小儿麻痹的比例大大增加。

(二)减毒活疫苗

在某些情况下微生物可以减毒,使其失去致病性但保留其接种后刺激机体免疫细胞增殖的能力。减毒通常可以通过改变致病细菌或病毒的培养条件,使它们在不正常的条件下生产,长时间在不正常条件下生长的病原体将会发生突变而不适合在正常的人体环境中生长。例如,减毒株卡介苗(BCG)通过将牛分枝杆菌在含有不断增加胆汁浓度的培养基中生长,13年后这一毒株已经适应高浓度的胆汁,毒力已经衰减到适合作为结核病疫苗。萨宾脊髓灰质炎疫苗(OPV)和麻疹疫苗都包含减毒病毒株,萨宾疫苗中使用的减毒脊髓灰质炎病毒毒株通过在猴肾上皮细胞中的生长而获得,减毒麻疹风疹病毒疫苗在鸭胚细胞和后来人类细胞系中生长获得。

图15-4 预防性疫苗的分类

减毒疫苗的优点是有复制能力,使这些病原体的抗原表位长时间暴露于免疫系统,从而增强机体的免疫力并促进记忆性细胞的增殖。因此,这些疫苗通常只需要一次免疫,这一点在不发达地区具有很重要意义。萨宾脊髓灰质炎疫苗是幼儿口服糖丸或糖液,它包括3个减毒脊髓灰质炎病毒株。减毒病毒在肠道细胞复制扩增,诱导针对3个脊髓灰质炎病毒的保护性免疫。萨宾疫苗激发肠道细胞分泌IgA,这是对脊髓灰质炎病毒的一个重要防御机制。该疫苗也引发IgM和IgG。不像大多数其他减毒疫苗仅需要免疫一次,萨宾脊髓灰质炎疫苗需要多次免疫。因为这3个菌株的减毒脊髓灰质炎病毒疫苗在肠道内干扰彼此的复制。第一次免疫一个应将占主导地位生长优先诱导免疫应答,第二次免疫之前生成的免疫应答将限制之前主要增长的毒株,使剩下的两个之一的毒株占主导地位诱导免疫。最后第三次免疫使所有3个毒株获得免疫应答。

减毒疫苗的一个主要缺点是毒力恢复。萨宾脊髓灰质炎疫苗的毒力恢复而致小儿麻痹症率达到1/240万。毒力恢复意味着这些病毒可以感染那些已经接种过疫苗的人。这些病毒通过水源、空气传播,特别是在卫生标准不严格的地区或废水必须回收利用的地区。基于这一点,一些国家仍然使用灭活脊髓灰质炎疫苗。

减毒活疫苗的复杂性类似于自然感染的疾病,很低比例的麻疹疫苗接受者会产生疫苗引起的脑炎或其他并发症。然而疫苗引发的风险低于感染病毒引发的风险。一个独立研究表明,1970～1993年7500万麻疹疫苗接种者中有48例由疫苗引起脑炎。非常小概率的不良反应对比感染造成的死亡率说明了疫苗的有效性。基因工程技术可以提供方法来减弱病毒毒力,选择性地去除基因病毒不可逆转毒力的必要条件。类似的基因工程技术有可能消除脊髓灰质炎减毒疫苗的风险。

(三)亚单位疫苗

当前肺炎链球菌疫苗包括23个抗原上不同的荚膜多糖,疫苗能够诱发抗体的形成,是目前对所有婴儿推荐使用的疫苗。此外,细菌性脑膜炎疫苗也包括纯化的荚膜多糖。多糖疫苗的一个劣势是无法高效激活细胞免疫,但可以充分激活B细胞产生IgM,但是不能转化成具有高亲和力的抗体。在这种情况下,疫苗可以通过细菌抗原激活黏膜表面IgA特异性的记忆性B细胞。因为这些细菌包括多糖和蛋白质抗原,能够激活Th细胞,进而介导抗原类型转化和记忆性细胞的形成。另一个方法是将多糖与抗原蛋白结合,直接激活Th细胞应答。例如,嗜血杆菌疫苗中多糖与蛋白的结合比单一多糖具有更强的免疫原性,可以激活Th细胞,增强IgM向IgG的转化。虽然这种类型的疫苗可以诱导记忆性B细胞,但是不能诱导记忆性T细胞。但对于嗜血杆菌疫苗来说,其能够通过B细胞激活一定程度的记忆性Th细胞,说明了疫苗的有效性。

(四)毒素疫苗

一些细菌病原如白喉杆菌和破伤风梭菌可以产生外毒素导致疾病。白喉和破伤风疫苗是通过纯化细菌外毒素后通过甲醛灭活产生的疫苗。接种疫苗后机体产生类毒素抗体,该抗体可以结合在毒素上从而起到中和毒素的作用。类毒素疫苗的生产必须密切控制解毒程度,不能过度修改表位结构。

(五)基因重组疫苗

利用DNA重组技术可以将任何编码免疫原性蛋白的基因克隆并表达于细菌、酵母、哺乳动物细胞系统中,表达的抗原蛋白产物可以用于疫苗开发。第一个批准的重组抗原疫苗是乙型肝炎疫苗,这种疫苗是由乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因克隆后在酵母细胞表达产生后制备。主要过程是将重组质粒转入酵母后大规模发酵,使得表面抗原蛋白在细胞中累积。收获表达后的酵母细胞并利用高压处理从而释放重组HBsAg,然后利用纯化技术获得所需的抗原蛋白。这种重组乙型肝炎疫苗在机体内能够诱导保护性抗体的产生。

(六)DNA疫苗

DNA疫苗早在20世纪90年代初由Tang和Johnston首先提出。他们在用人类生长素基因进行基因治疗时,用基因枪将DNA导入皮肤,发现这技术能对转入的抗原蛋白产生特异抗体。在1992年疫苗年会上,3名冷泉港实验室成员报告DNA重组载体在体内能促进对病原体和肿瘤抗原的体液和细胞免疫应答。Margeret Liu及其同事发现,肌内注射裸露的质粒抗原能产生抗流感病毒的免疫反应。同时Robinson也发现DNA质粒激起抗流感病毒的免疫反应。Wang和Weiner发现携带HIV或肿瘤抗原在小鼠体内能产生免疫反应和保护作用。这些研究使用不同的传递方法和重组质粒,为疫苗的可开发性提供了实验证据。

在过去的10多年里,DNA疫苗已经应用在抵御各种病原体和肿瘤中。这种疫苗已充分证明了安全性,不仅方法独特,技术简单,还能激活特异性免疫反应。更重要的是,DNA疫苗不仅激起体液免疫,还能影响细胞免疫,DNA疫苗可诱导细胞毒性T细胞(CTL),在新型疫苗研发领域是一个重要进步。DNA疫苗克服了灭活疫苗的生物安全问题,如在灵长类动物中接种减毒活猴免疫缺陷病毒(SIV)疫苗会造成一定比例的感染。此外它也避免了灭活疫苗生产过程中的风险,如脊髓灰质炎病毒灭活后仍然存在活病毒的污染。

近年研究表明,虽然DNA疫苗具有广泛的优越性,但在大动物和人体中的免疫效力还不及减毒活疫苗有效,并未达到人们的期望。研究者开始考虑如何使得表达的抗原更有效地被APC加工呈递或增强与APC的相互作用从而提高其免疫原性。

建立在报告基因基础上的研究显示,DNA疫苗进入机体的方式不同,其引发免疫反应的起点差别很大。如用质粒电击表皮则倾向于直接转染表皮角化细胞和郎格罕斯细胞,质粒能快速迁移到局部淋巴结。此时抗原呈递的地点和共刺激分子的来源很明显,就是被转染的郎格罕斯细胞,因为郎格罕斯细胞是专职的APC,抗原可以在APC内表达并被加工、呈递,同时上调共刺激分子;而如果是用肌内注射的方式传递DNA疫苗,此时主要是肌细胞被转染。由于肌细胞不产生共刺激分子,其表达的抗原或质粒必须被专职APC所摄取,专职APC对此途径传递的质粒摄取量也较少。研究表明,骨髓嵌合体鼠中骨髓来源的APC对DNA疫苗诱导MHCⅠ类CTL是绝对必需的;将稳定转染流感核蛋白基因的肌原细胞进行移植同样可以产生MHCⅠ类CTL,骨髓嵌合体鼠的研究也显示限制因素是骨髓APC的MHC而不是肌细胞本身。移植的肌细胞可以向CD8+T细胞以交叉呈递的方式呈递抗原,但确切机制有待进一步研究。专职APC对凋亡细胞的摄取,加工后肽的转运(单独或与热休克蛋白一起)是可以发生的。在凋亡小体中的EB病毒或HIVDNA能被转运至APC,而且病毒表位能够被MHCⅠ类分子有效呈递。蛋白以及与热休克蛋白形成复合物的肽可以被APC再呈递。抗原与热休克蛋白或单纯疱疹病毒VP22蛋白的融合可促进APC分泌型蛋白的内化,报道表明这种融合能提高肌内注射DNA疫苗的免疫效果。流感病毒核蛋白能够形成病毒样颗粒,也能高效地从感染细胞中释放出来,MHCⅠ类分子能够在体内加工和呈递的外源性抗原包括病毒样颗粒。因此,肌肉DNA免疫能够引起常规的免疫激活以及交叉免疫呈递(见图15-5),这种呈递可以发生在蛋白水平,也可以发生在核酸水平。最近的一些旨在提高DNA疫苗免疫效果的研究主要集中在提高专职APC对质粒的摄取和表达,以及加强传统的MHCⅠ类分子激活途径等方面。

对质粒DNA本身免疫特性的研究发现,含有非甲基化CpG序列的细菌DNA被发现在体外能起B细胞多克隆激活的作用,在体内能起佐剂的作用。进一步的研究显示,含非甲基化CpG序列的寡核苷酸是通过TLR9激活靶细胞的。为了在体内显示对蛋白抗原的佐剂效果,要用到微克剂量的CpG寡核苷酸。更进一步的研究发现,质粒DNA疫苗在正常和TLR9基因敲除小鼠中都有免疫原性。在一系列动物实验中,通过混合编码和非编码质粒来提高肌内注射质粒的总量,可以明显提高后续的免疫反应,提高质粒用量对TLR9没有影响,但对DNA的加工或摄取会有影响,但机制还不清楚。

图15-5 DNA疫苗机理图

细胞因子或趋化因子以质粒或蛋白的形式与DNA疫苗同时免疫能够提高免疫效果。实验显示,白细胞介素12(IL-12)的DNA与HIV的DNA质粒同时应用可提高Th1免疫并降低Th2反应;IL-2与粒细胞、巨噬细胞、集落刺激因子(GM-CSF)联合应用可增强体液和细胞免疫反应;GM-CSF在几个HIVDNA疫苗的初免实验中取得了成功并可扩大初免效果;Letvin等在研究中发现用编码HIV抗原和IL-2的DNA免疫猴可提高细胞免疫反应并能抵抗致病剂量的猴-人免疫缺陷病毒的攻击。因为重组细胞因子与细胞因子基因产物的药物动力学和生物分布的详细研究通常没有与免疫反应研究同步进行,所以还很难将这些不同种系、不同动物模型的实验进行整合,需要更多的研究。