生物样品分析前处理技术

（一）蛋白质的去除

在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使蛋白结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度；也可减免后续溶剂萃取过程中乳化现象的出现；同时可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限。去除蛋白质常用的方法如下。

1.加入与水混溶的有机溶剂 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，进而使与之结合的药物释放。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1 ∶（1～3）时，即可去除90%以上的蛋白质。水溶性有机溶剂种类的不同，析出的蛋白质的形状亦不同，且所得上清液的pH值也稍有差别。如用乙腈时，析出的蛋白质为絮状，易于离心去除；用甲醇时，则为细小颗粒状，需高速离心去除。使用乙腈或甲醇时，上清液pH = 8.5～9.5；而用丙酮时，上清液pH=9～10。操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离，取上清液作为样品，通常分离血浆或血清用的离心速度（3000 r/min）难以将蛋白质沉淀完全，而采用高速（10000 r/min）离心1～2 min便可将析出的蛋白质沉淀完全。

2.加入中性盐 加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化，并将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸椽酸盐等。操作时，按血清与饱和硫酸铵的比例为1∶2混合，离心（10000 r/min）1～2min，即可除去90%以上的蛋白质。所得上清液的pH=7.0～7.7。将盐析的方法与有机溶剂萃取法并用时，可提高药物的回收率，因而常常被采用。

3.加入强酸 当溶液的pH值低于蛋白质的等电点时，以阳离子形式存在的蛋白质可与酸根阴离子形成不溶性盐而沉淀析出。常用的强酸有：10%三氯醋酸、65%高氯酸、5%偏磷酸等。含药物血清与强酸以1∶0.6的比例混合，离心（10000 r/min）1～2 min，即可去除90%以上的蛋白质。所得上清液呈强酸性（pH=0～4），在酸性条件下分解的药物不宜用本法去除蛋白质。过量的三氯

醋酸可经煮沸分解为三氯甲烷和二氧化碳而被去除；过量的高氯酸可用碳酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和后，加乙醇使之生成高氯酸钾（钠）沉淀而被去除；偏磷酸可用同法去除。

4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH值高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带负电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有CuSO4-Na2WO4和ZnSO4-NaOH。含药物血清与沉淀剂以1∶2的比例混合，离心（10000 r/min）1～2 min，分离后所得的上清液pH值分别为5.7～7.3和6.5～7.8。

5.酶解法 在测定某些与蛋白质结合牢固且对酸不稳定的药物时，常需用酶解法使蛋白质分解而释出药物。枯草菌溶素是最常用的一种细菌性碱性蛋白质分解酶，可在较宽的pH值范围（pH=7.0～11.0）内使蛋白质的肽键降解，在50～60℃时具有最大的活力。

酶解法操作简便。先将待测组织加入Tris-缓冲液（pH=10.5）及酶，在60℃培育1h后，用玻璃棉过滤，所得的澄清滤液即可供药物萃取用。

（二）缀合物的水解

尿中药物多数呈缀合状态。一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸酷缀合物。 由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂萃取。为了测定尿液中药物总量，无论是直接测定或萃取分离之前，都需将缀合物中的药物释出。有些药物仅需较温和条件即可游离，有些则需较剧烈的方法，常用酸水解或酶水解的方法。

酸水解时，可加入适量的盐酸溶液进行水解。对于遇酸及受热不稳定的药物，可采用酶水解法，常用葡糖酸苷酶、硫酸酷酶或两者的混合物。虽然酶水解法存在水解时间长、酶制剂带入的黏液蛋白可能导致乳化及色谱柱污染等缺点，但酶水解法具有较高的选择性，很少使被测药物或共存物发生降解，所以常被优先选用。

（三）有机质破坏

生物样品中的金属离子常与蛋白质结合且难以用溶剂萃取，常需对有机质进行破坏，方法参考其他章节。通常使用硝酸-高氯酸作为消解剂，本法破坏能力强，适用于各种生物样品的破坏。经本法破坏后，所得的金属离子，一般为高价态。

（四）分离、纯化与浓集

对于药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，生物样品需进行分离、纯化与浓集处理，或在去除蛋白质或缀合物水解的基础上进一步进行处理。

1.液-液萃取法（liquid-liquid extraction， LLE） 多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性干扰物是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂萃取可去除大部分干扰物。应用本法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH等。对所选用的有机溶剂，要求对被测组分的溶解度大，沸点低，易于挥发浓集；与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等。最常用的溶剂是乙醚和三氯甲烷等。萃取时所用的有机溶剂要适量。一般有机相与水相（体液样品）的容积比为1∶1或2∶1。根据被测药物的性质及方法的需要，可经实验考察其用量与测定响应值之间的关系，来确定有机溶剂的最佳用量。pH值的影响在溶剂萃取中十分重要。水相的pH值随药物的理化性质的不同而异，但生物样品一般多在碱性下萃取。这是因为多数药物是亲脂性的碱性物质，而生物样品中的内源性物质多数是酸性的，所以在碱性下用有机溶剂萃取被测药物时，内源性干扰物质不易被同时萃取。

2.液-固萃取法（liquid-solid extraction， LSE） 液-固萃取法是近十几年来在纯化生物样品时广泛被采用的方法。它是一种柱色谱分离方法，是将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或内源性干扰物保留在担体上，用适当溶剂洗去干扰物后，再用适当溶剂将药物洗脱下来。Bond Elut微型柱采用各种极性、非极性硅胶键合填料，Sep-pak系列常用C18、硅胶、硅酸镁、氧化铝等4种填料。

3.被测组分的浓集 浓集的方法主要有两种：一种方法是在末次萃取时加入的萃取液尽量少，使被测组分萃取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。另一种方法是挥去萃取溶剂法。挥去溶剂时应避免直接加热，防止被测组分破坏或挥发损失。挥去萃取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可采用减压法挥去溶剂。

（五）化学衍生化

生物样品经化学衍生化后再进行分离的目的是：①使样品中的药物转变成具有可被分离的性

质；②提高检测的灵敏度；③增强药物的稳定性；④提高对光学异构体分离的能力等。

药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如含—COOH、—OH、—NH2、—NH—、—SH等官能团的药物都可被衍生化。化学衍生化对GC和HPLC尤为重要。

GC中化学衍生化法：药物的化学衍生化前处理对GC十分必要，衍生化可使药物分子中的极性基团，如羟基、氨基、羧基等变成无极性的、易于挥发的药物，从而使GC温度不必很高即可适合GC的分析要求，主要的衍生化反应有烷基化（alkylations）、 酰化（acylations）、硅烷化（silylations）等。其中以硅烷化应用最广泛。

常用的烷基化试剂有：碘庚烷、叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺（TMAH）等；常用的酰化试剂有：乙酸酐、丙酸酐等；常用的硅烷化试剂有：三甲基氯硅烷（TMCS）、双-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（ TMTS）等。

具有光学异构体的药物，由于RS构型不同，使之具有不同的药效和药动学特性。因此，异构体的分离也是十分重要的。分离光学异构体的方法之一，就是采用不对称试剂，使其生成非对映异构体衍生物，然后用GC法或HPLC法进行分析测定。常用的不对称试剂有：（S）-N-三氟乙酰脯氨酰氯、（S）-N-五氟乙酰脯氨酰氯等。