猫爪草乙酸乙酯柱层析部位体外抗肿瘤活性筛选

（一）主要材料与仪器

1．受试药物　猫爪草乙酸乙酯柱层析分离TY1，TY2，TY3，TY4，TY5　5个部位，氟尿嘧啶（5－FU）。

2．细胞株及细胞　人肺癌细胞株A－549，人白血病细胞株HL－60及人宫颈癌细胞株He－la。

3．试剂　RPMI－1640培养基干粉、胰蛋白酶、小牛血清（FCS）、MTT［3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑］及BCG与LPS，D－Hanks液、二甲亚砜（DMSO）、氯化钠注射液、吐温－80。

4．仪器　CO2恒温培养箱、超净工作台、倒置显微镜、酶联免疫仪、低速离心机、培养瓶、96孔平底细胞培养板、液氮罐等。

（二）体外抗肿瘤活性测定方法

5个样品组各设4个不等浓度，用含有DMSO的氯化钠注射液充分溶解，以相应的空白溶液为对照，用MTT和SRB两种方法进行体外对3种肿瘤细胞增殖的影响。

1．MTT比色法　采用RPMI－1640培养液，含青霉素10万U／L，链霉素10万U／L，10%新生小牛血清（FCS，56℃灭活30min），缓冲液调pH至约7．2，将待测细胞株配成单个细胞悬液。取对数生长期细胞以0．25%胰蛋白酶和0．02%EDTA消化后，用培养液稀释至浓度（4～5）×104／ml，接种于96孔板，每孔加入190μl。同时设溶剂对照，每个剂量设3个平行孔，常规培养24h后，加入不同剂量的受试药物，在37℃饱和湿度、5%CO2培养箱中培养72h后，每孔加入MTT溶液（用生理盐水配制）10μl（5mg／ml），振荡混匀后，继续培养4h。吸去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜，轻轻振荡，约1h后，用酶标仪在570m波长处测其OD值，计算抑制率，求IC50，测定时减去空白对照。按下列公式计算抑瘤率：

抑瘤率＝（1－实验组OD值／对照组OD值）×100%

2．磺酰罗丹明B（sulforhodamine B，SRB）比色法　细胞接种和药物处理同MTT法，空白对照液只加完全培养液，不加细胞。药物处理48h后，每孔加入50μl冰冻的50%三氯醋酸。4℃固定1h后，用自来水洗去三氯醋酸、培养剂、小分子量代谢产物以及血清蛋白。将培养板纸在空气中干燥，用0．4%SRB（W／V，1%醋酸溶解）对三氯醋酸固定的细胞染色30min，随后用1%醋酸洗去游离染料，置于空气中干燥样品；每孔加入150μl　10mmol／L Tris，轻轻振荡，直至染料全部溶解。于564nm波长处测OD值，测定时应减掉空白OD值。细胞生长抑制率计算方法同上。

（三）实验结果和结论

1．猫爪草乙酸乙酯TY1，TY2，TY3，TY4，TY5　5个部位对人白血病细胞株HL－60，人肺癌细胞株A－549及人宫颈癌细胞株Hela作用有明显差异，结果见表3－2～表3－4。

表3－2　猫爪草乙酸乙酯柱层析部位用MTT法对人白血病细胞株HL－60的作用

（1）P＜0．05；（2）P＜0．01与阴性对照组比较

表3－3　猫爪草乙酸乙酯柱层析部位用SRB法对人肺癌细胞株A－549的作用

（1）P＜0．05；（2）P＜0．01与阴性对照组比较

表3－4　猫爪草乙酸乙酯柱层析部位用SRB法对人宫颈癌细胞株Hela的作用

（1）P＜0．05；（2）P＜0．01与阴性对照组比较

2．从表3－2～表3－4中可以看出，猫爪草乙酸乙酯柱层析分离部位除TY1外，TY2，TY3，TY4，TY5　4个部位均有明显的抑瘤作用，与阴性对照组比较有显著性差异。TY2抑瘤效果最强，对人白血病细胞株HL－60，人肺癌细胞株A－549及人宫颈癌细胞株Hela　3种细胞株的作用，在给受试样品的最大剂量下，其细胞抑制率均＞65%，且其给药量与抑瘤率呈一定的正相关关系。TY3对HL－60在给受试样品的最大剂量下，其细胞抑制率＞50%，但对A－549及Hela两种细胞株作用不明显。TY4对HL－60及A－549在给受试样品的最大剂量下，其细胞抑制率均＞50%，但对Hela细胞株作用不明显。TY5对A－549及Hela作用明显，对Hela细胞株在10μg／ml的抑瘤率高于100μg／ml，给药量与抑瘤率无正相关关系，但对HL－60细胞株作用不明显。说明猫爪草乙酸乙酯部位经柱层析分离分割为5个部位后，4个部位对实验用3种细胞株均有明显的抑瘤作用，但作用有一定的差异，从直观分析可看出TY2部分抑瘤效果最强。

通过对猫爪草乙酸乙酯柱层析分离部位（TY1，TY2，TY3，TY4，TY5）5个样品组各设4个不等浓度，用含有DMSO的氯化钠注射液充分溶解，以氟尿嘧啶（5－FU）为对照，用MTT和SRB两种方法进行体外对人肺癌细胞株A－549，人白血病细胞株HL－60及人宫颈癌细胞株Hela共3种肿瘤细胞增殖的影响进行试验，结果除TY1外，TY2，TY3，TY4，TY5　4个部位均有明显的抑瘤作用，在给受试样品的最大剂量下，对3种细胞株的抑制率均＞65%，且其给药量与抑瘤率呈一定的正相关关系。TY3对HL－60在给受试样品的最大剂量下，其细胞抑制率＞50%，但对A－549及Hela两种细胞株作用不明显。TY4对HL－60及A－549在给受试样品的最大剂量下，其细胞抑制率均＞50%，但对Hela细胞株作用不明显。TY5对A－549及Hela作用明显，对Hela细胞株在10μg／ml的抑瘤率高于100μg／ml，给药量与抑瘤率无正相关关系，但对HL－60细胞株作用不明显。说明猫爪草乙酸乙酯部位经柱层析分离分割为5个部位后，4个部位对实验用3种细胞株均有明显的抑瘤作用，但作用有一定的差异，从直观分析可看出TY2部分抑瘤效果最强。