(一)主要仪器和材料
WRS-1B数字熔点测定仪、红外光谱仪、Bruker ARX600磁共振仪、EI-MS-QP5050质谱测定仪、BUCHI型旋转薄膜蒸发器、葡聚糖凝胶LH-20及柱层析用硅胶、硅胶H、猫爪草乙酸乙酯柱层析5个分离部位TY1,TY2,TY3,TY4,TY5,石油醚、氯仿、乙酸乙酯等。
(二)方法与结果
对乙酸乙酯柱层析分离部位TY1,TY2,TY3,TY4,TY5上葡聚糖凝胶LH-20柱层析、氯仿-甲醇(5∶5)洗脱,进行再纯化,薄层层析检视,直至选用3种展开剂均为同一斑点时,再用熔点测定仪测定熔点,运用Mp[α],EI-MS,NMR等现代技术进行了结构测定,结果从中分离鉴定了以下10个化合物。
1.化合物Ⅰ(15mg) 白色粉末状结晶(乙酸乙酯),为二十八烷酸(n-octacosanoic acid)。分子式:CH3(CH2)26COOH`,解析过程如下。
熔点(mp)78~80℃,溴酚蓝反应呈黄色,示为羧酸类化合物。IR(KBr)cm-1:3126(OH),2917(CH2和CH3反对称伸缩振动),2850(CH2和CH3对称伸缩振动),1463,1400(C—H伸缩与弯曲振动),1710(C O),728[ρCH峰,示-(CH2)n-中n≥4]。由13 CNMR(CDCl3)谱可知,分子中含有一个羧酸羰基(179.220),其余碳化学位移δ均处于较高场(0~40),为烷烃类饱和碳原子,以上特征提示化合物为一长链脂肪酸。1 HNMR(CDCl3).349处信号峰为与羰基相连的—CH2—,受C O吸电子影响处于较低场。1.0~1.7为长链—CH2—的堆积峰,0.870处3个氢为甲基峰,与—CH2—相连,分裂为三重峰。结合EI-MS(m/z)谱:424(M+),396(M+—C O),382,368……73(M+—C13H27),43[M+—(CH2)12COOH],以上MS数据符合脂肪酸的裂解规律,呈现一系列相差14(CH2)的碎片峰,并出现73,129,185等相差56的含羧基的离子碎片峰。综上分析与文献报道二十八酸数据基本一致。
2.化合物Ⅱ(18mg) 白色粉末状结晶(乙酸乙酯),二十碳酸(n-eicosanoic acid)。
解析过程:mp 75~76℃,溴酚蓝反应呈黄色。EI-MS(m/z)谱:312(M+),311(M+—H),297(M+—CH3),283,269,255,241,227……71,57,43,以上MS数据符合文献报道的脂肪酸的裂解规律,呈现一系列相差14(CH2)的碎片峰,并出现73,129,185,241,297等相差56的含羧基的离子碎片峰。由13CNMR(CDCl3)谱可知,分子中含有一个羧酸羰基(δ179.771),其余碳化学位移δ均处于较高场(0~40),为烷烃类饱和碳原子,以上特征提示化合物为一长链脂肪酸。1 HNMR(CDCl3)谱δ:2.343处二氢分裂为三重峰,与—CH2—相连,且受C=O吸电子影响处于较低场。1.0~1.7为长链—CH2—的堆积峰,0.878处3个H为甲基峰,与—CH2—相连,分裂为三重峰。综上分析可确定化合物为二十碳酸(n-eicosanoic acid)。
3.化合物Ⅲ(560mg) 白色有光泽的鳞片状结晶,为十六碳酸(Hexadecanoic acid),又名软脂肪酸或棕榈酸(palmitic acid)。
解析过程:mp 62~63℃(氯仿),溴酚蓝反应呈黄色。EI-MS(m/z)谱确定其分子式为C16H32O2(M+:256,计算值:256);并且与已知化合物十六碳酸的质谱信息完全一致。1 HNMR谱)给出了下列质子信息,即δ:2.35(2H,d,α-H),δ1.62(2H,d,β-H),δ1.25(24H,S)为δ值相近的12个亚甲基质子的强耦合信号,δ0.88(3H,t)为长直链烷基末端甲基质子信号。13CNMR谱碳信号的归属如下:δ180.2是羧基碳信号(C-1)、δ34.1为α-C信号(C-2)、δ31.9为β-C信号(C-3),δ29.4(C-4),δ29.7为碳链中间8个δ值近似的亚甲基碳共振信号(C5~C12),δ29.4(C-13),δ24.7(C-14),δ22.7(C-15),δ14.2是长直链饱和羟基末端甲基碳信号(C-16)。综合上述信息,确定化合物Ⅳ为十六碳酸。
4.化合物Ⅳ(137mg) 白色鳞片状结晶,为β-谷甾醇(β-sitosterol)。
解析过程:mp 136~137℃(氯仿),易溶于乙醚、氯仿、难溶于水,Liberman-Burchard反应呈绿色,与三氯化锑试剂反应呈紫色,说明其为甾体化合物。EI-MS(m/z)谱,确定其分子式为C29H50O(M+:414,计算值414);1 HNMR谱(DMSO-d6)13 CNMR谱(CDCI3))。碳信号的归属如下:δ37.3(C-1),δ31.6(C-2),δ71.8(C-3),δ42.3(C-4),δ140.8(C5),δ121.7(C-6),δ31.9(C-7),δ31.9(C-8),δ50.1(C-9),δ36.5(C-10),δ21.1(C-11),δ39.8(C-12),δ42.3(C-13),δ56.8(C-14),δ24.3(C-15),δ28.3(C-16),δ56.1(C-17),δ19.0(C-18),δ11.98(C-19),δ36.2(C-20),δ19.0(C-21),δ33.9(C-22),δ24.3(C-23),δ45.8(C-24),δ29.1(C-25),δ19.8(C-26),δ18.8(C-27),δ23.1(C-28),δ11.9(C-29)。与β-谷甾醇的文献谱图一致,综上信息确定化合物Ⅵ的结构为豆甾-5-烯-3β-醇,即为β-谷甾醇(β-sitosterol)。
5.化合物Ⅴ(120mg) 白色粉末,为β-棕榈酸甘油酯。
解析过程:mp 72~75℃,EI-MS m/z(%):331(M++1,1.3),330(M+,2.7),257(9.2),239(38.0),154(6.0),134(30.0),98(71.2),74(63.2),43(100)。1 HNMR(pydine)δ:5.57(1H,m,J=5.8Hz,CH*OC O),5.32(4H,d,J=5.8Hz,CH2*OH),3.44(2H,t,J=7.3Hz,CH2*C O),2.53~2.40(26H,m),1.98(3H,t,J=7.5Hz,CH3)。13CNMR(pydine)δ:173.2(1-C),73.8(2′-C),64.6(1′,3′-C),34.22(2-C),29.8~29.2(3~14-C),22.7(15-C),14.0(16-C)。根据以上数据确定为β-棕榈酸甘油酯。对其进行碱水解,得到了棕榈酸。
6.化合物Ⅵ(82mg) 白色粉末,为β-硬脂酸甘油酯。
解析过程:mp 76~78℃,EI-MS m/z(%):359(M++1,0.9),358(M+,1.6),285(11.3),267(26.4),239(12.8),154(14.8),134(54.0),112(32.0),98(100),74(67.2),43(99.2)。1 HNMR(pydine)δ:5.65(1H,m,J=5.2Hz,CH*OC O),5.35(4H,d,J=5.2Hz,CH2*OH),3.48(2H,t,J=7.3Hz,CH2*C O),2.53~2.40(30H,m),1.92(3H,t,J=7.1Hz,CH3)。13 CNMR(pydine)δ:173.7(1-C),73.0(2′-C),64.4(1′,3′-C),34.0(2-C),29.7~29.1(3~16-C),22.5(17-C),14.1(18-C)。HMBC谱中甘油2′-H与硬脂酸羰基C有远程相关,说明硬脂酸与甘油2′位成酯。根据以上数据确定为β-硬脂酸甘油酯。
7.化合物Ⅶ(53mg) 白色膏状物,为邻苯二甲酸正丁酯。
解析过程:易溶于石油醚,mp 46~49℃,EI-MS m/z(%):278(M+,0.40),223(4.80),205(4.0),149(100),121(3.2),104(6.0),76(6.4),65(4.0),41(6.8)。1 HNMR(DMSO)δ:7.69(2H,br.,J=6.7Hz,3,6-H),7.51(2H,t,J=6.7Hz,4,5-H),4.14(2H,t,J=7.0Hz, 1′-H),1.36(2H,m,J=7.0Hz,2′-H),1.18(2H,m,J=7.0Hz,3′-H),0.89(3H,t,J=7.0Hz,4′-H);13CNMR(DMSO)δ:187.1(C O),132.8(1,2-C),1136.9(4,5-C),129.2(3,6-C),68.1(1′-C),29.0(2′-C),22.9(3′-C),14.4(4′-C)。根据以上数据确定此化合物为邻苯二甲酸正丁酯。
8.化合物Ⅷ(82mg) 无色针晶,为3,4-二羟基-苯丙氨酸乙酯。
解析过程:mp 123~126℃,EIMS m/z(%)):226(M++1,6.8),225(M+,3.2),196(2.4),152(2.8),123(100.0),107(3.6),89(1.2),77(13.2),51(9.6)。1 HNMR(DMSO)δ:8.68(1H,br.,6-OH),8.60(1H,br.,7-OH),6.64(1H,d,J=7.7Hz,8-H),6.58(1H,d,J=2.5Hz,5-H),6.42(1H,dd,J=7.7Hz,2.5Hz,9-H),5.43(2H,d,J=19.9Hz,2-NH2),4.12(1H,m,2-H),4.04(2H,q,J=7.0Hz,1′-H),2.75(1H,dd,J=11.7Hz,5.7Hz,3-aH),2.64(1H,dd,J=11.7Hz,5.7Hz,3-bH),1.15(3H,t,J=7.0Hz,2′-H)。13 CNMR(DMSO)δ:174.7(1-C),145.4(6-C),144.3(7-C),128.9(4-C),120.7(5-C),117.4(8-C),115.9(9-C),72.3(2-C),60.5(1′-C),41.3(3-C),14.7(2′-C)。由以上数据确定此化合物为3,4-二羟基-苯丙氨酸乙酯。
9.化合物Ⅸ(34mg) 棕红油状物,为5-羟甲基糠醛。
解析过程:EI-MS m/z(%):126(M+,78.0),125(14.4),109(13.6),97(100.0),81(5.6),69(32.8),53(14.4),41(73.3)。1 HNMR(DMSO)δ:9.54(1H,s,2′-H),7.47(1H,d,J=3.5Hz,3-H),6.59(1H,d,J=3.5Hz,4-H),5.55(1H,br.,5′-OH),4.51(2H,s,5′-H)。13CNMR(DMSO)δ:178.5(2′-C),162.8(2-C),152.4(5-C),124.9(3-C),110.3(4-C),56.6(5′-C)。以上数据与文献报道5-羟甲基糠醛一致。
10.化合物Ⅹ(27mg) 无色粉末,为5-羟甲基糠酸。
解析过程:mp 169~172℃,EI-MS m/z(%):142(M+,19.6),124(4.4),97(100),96(11.6),79(16.0),69(26.8),51(34.8),41(42.8)。1 HNMR(MeOD)δ:7.15(1H,d,J=3.4Hz,3-H),6.46(1H,d,J=3.4Hz,4-H),4.75(1H,br.,5′-OH),4.57(2H,s,5′-H)。13CNMR(MeOD)δ:161.8(2′-C),160.6(2-C),145.8(5-C),119.8(3-C),110.1(4-C),57.5(5′-C)。以上数据与文献报道5-羟甲基糠酸一致。
本实验从猫爪草乙酸乙酯部位分离鉴定了10种化合物,其中:二十八烷酸(n-octacosanoic acid)、β-棕榈酸甘油酯(glycerolβ-palmitate)、β-硬脂酸甘油酯(glycerolβ-steariate)、邻苯二甲酸正丁酯(1,2-benzenedicarboxylic acid,dibutyl ester)、3,4-二羟基-苯丙氨酸甲酯(3,4-dihydroxyl-phenylalanine methyl ester)、5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl furaldehyde)、5-羟甲基糠酸(5-hydroxymethyl furoic acid)等7种成分系首次从毛茛属植物中得到。
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