猫爪草中的糖类

（一）主要仪器和材料

紫外可见分光光度计、葡萄糖、乙醇、硫酸、蒽酮、猫爪草样品为6个不同产地的野生及栽培品。

（二）方法

1．溶液配制

（1）对照品溶液：精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品（C6H12O6·H2O）0．116　4g于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀得对照品储备液（Ⅰ）。

（2）供试品溶液的制备

①总糖溶液：取药材粉末（60目）0．25g，精密称定，于150ml烧瓶中，精密加入50ml蒸馏水，称重，回馏提取60min，冷却，称重，补足重量，过滤，弃5ml前滤液，精密吸取续滤液1．0ml于25ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，即得。

②多糖溶液：精密量取续滤液5．0ml于50ml小烧杯中，水浴上挥干后，加入1ml蒸馏水溶解，加10ml无水乙醇，静置30min，过滤，将沉淀全部转移至滤纸中，用蒸馏水－无水乙醇（1∶10）的溶液充分洗涤沉淀后，将带滤纸的漏斗移至25ml的容量瓶上，分批用蒸馏水将沉淀完全溶入容量瓶中，用蒸馏水定容，即得。

2．测定波长的选择　将溶液显色，在波长400～800nm间进行光谱扫描，结果对照品和供试品均在波长624～626nm间有最大吸收，因此，选择625nm作为测定波长。

3．测定方法　精密量取供试品溶液试液1．0ml于10ml具塞试管，置冰水浴中，显色剂4．0ml，在沸水浴中显色反应10min后，取出置冰水浴中10min，室温放置10min，同时量取蒸馏水1．0ml，同法操作，作参比溶液，按《中国药典》2005版一部附录ⅤA紫外－可见分光光度法，在625nm处测定吸光度。

4．方法学考察

（1）标准曲线及线性范围：精密吸取储备液（Ⅰ）1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0ml分别于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀得对照品溶液B1，B2，B3，B4，B5，B6。分别精密量取各对照品溶液1．0ml按测定方法项下的方法进行操作，得回归方程为：A＝10．964C－0．031　3，r＝0．999　7，线性范围10．58～63．49μg／ml。

（2）精密度、重复性、稳定性试验：取B3溶液连续重复测定吸光度6次，计算得RSD为0．35%，表明仪器性能良好。取药材（批号6）粉末6份，重复6份，所得含量的RSD分别为1．35%，符合方法要求。对其中的一份溶液在5h内测定吸光度，稳定性试验结果：RSD为1．06%，显色溶液稳定。

（3）加样回收率试验：取药材（批号：6，总糖含量21．10%）粉末0．12g，精密称定，置150ml烧瓶中，共6份，分别1．040mg／ml的葡萄糖对照品溶液（C6H12O6·H2O）0．286　0g于250ml容量瓶）25ml，蒸馏水25ml，按测定方法项下的方法操作，测定总糖的含量，以总糖计算回收率。

5．含量测定　以建立的分析方法测定6份不同产地的药材样品总糖与多糖的含量，结果表明，糖含量差异较大。

（三）结果

1．显色反应条件优化　通过分别对加入显色剂2．5ml、3．0ml、3．5ml、4．0ml、4．5ml，在90，95，100℃下显色反应5min，10min，15min，20min，室温放置10min，30min，60min，120min，240min后测定溶液吸光度的试验，表明显色反应条件以测定方法项下所列方法合适。

2．提取方法试验　经比较回流法和超声法，本文选用回流法，取药材粉末0．5g，分别回流30min，60min，120min，180min，及加50ml，75ml，100ml蒸馏水，按测定方法项下的方法，测定溶液吸光度，分别考察提取时间及水的用量。结果表明，最佳提取时间为60min，提取水量为100ml。

3．多糖沉淀条件优化　通过分别加入5倍、10倍、15倍量的无水乙醇沉淀多糖，将沉淀溶解，测定溶液吸光度，考察醇量。结果表明，10倍量无水乙醇沉淀多糖的损失最少。精密量取5．0ml回流提取的续滤液3份于50ml小烧杯中，水浴上挥干，分别加入0．5ml，1ml，2ml蒸馏水溶解，分别加入10倍量无水乙醇，静置30min，过滤，按测定方法项下的方法，测定溶液吸光度，结果表明以1ml溶解多糖较合适。

本研究通过显色反应条件试验，确定了显色剂用量、反应温度、反应时间，建立了相对比较稳定的显色反应方法。研究中分别就提取方法、提取条件及多糖沉淀条件等进行了试验，建立了测定总糖和多糖含量的方法，并进行了方法学考察，方法简便，有可操作性。以建立的方法测定了不同产地、野生、种植产品的总糖和多糖的含量结果表明，糖含量差异较大。总糖12．10%～35．66%，多糖0．55%～2．17%。

有关多糖的含量，不同学者由于猫爪草样品来源及测定方法的差异所得的结果有所不同。中国医学科学院药物所测定，猫爪草含糖16%。贾慧青等学者使用O－T试剂法测得猫爪草总糖含量为13．8%，多糖含量为3．2%。王鲁石等学者用水提醇沉法提取猫爪草多糖，采用苯酚－硫酸比色法对其多糖进行测定，测得多糖量为6．7%。南京中医药大学的吴晓等学者对来自河南、安徽、四川、南京的6个野生及栽培品猫爪草样品进行了系统研究，结果总糖12%～22%，多糖3%～7%，含量差异较大。我们对河南信阳、河南驻马店、安徽、浙江、江苏、湖北、山东等地等5个不同产地猫爪草中多糖含量进行了比较，测得的结果显示，不同产地猫爪草中多糖的含量差异明显，5个不同产地猫爪草中7个样品多糖含量分别为12．65%，12．05%，10．46%，9．78%，8．49%，8．73%，9．47%，其中以河南产猫爪草中多糖含量最高。在多糖分离研究方面，日本学者从猫爪草根中分离得到了葡萄糖、阿拉伯糖及半乳糖，国内陈彦、戴玲等学者采用DEAE－Cellulose－52和Superdex　200柱色谱得到均一的多糖组分，电泳和凝胶色谱等方法检测纯度，薄层色谱和气相色谱分析单糖组成，红外光谱确定糖苷键类型，得到的多糖RTG－Ⅲ是以β－D－葡萄吡喃糖为主的一种多糖－蛋白复合物，相对分子质量为2．3×104，能够增强免疫细胞对肿瘤细胞HL－60的抑制作用；单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖，其摩尔比为1．00∶1．17∶51．71∶2．16∶0．46，总糖含量为80．1%，蛋白含量为12．6%，由谷氨酰胺、谷氨酸等16种氨基酸组成，糖肽键为非O－型。张幸国等从猫爪草中的乙酸乙酯部位分离得到β－D－葡萄糖。目前多糖的研究及分离分析仍然是一个比较活跃的研究领域，其结构鉴定也是一个较复杂的问题，不同学者所得结论的差异与所用的测试手段及选择的样品有关，仍然有待多学者进一步研究。