小毛茛内酯对结核休眠菌感染病人

（一）资料和方法

1．靶细胞PBL采集的试验对象　确诊的275例肺结核病人中经至少1个以上疗程的常规全程联合化疗后，痰菌培养仍阳性且结核菌16kDα－晶状体同源蛋白DNA阳性的56例患者选为本研究实验对象。

2．病人PBL中结核菌DNA的提取　结核菌DNA提取的方法参照Strehlau等文献。

3．结核菌16kDα－晶状体同源蛋白基因的PCR检测　引物设计：引物1∶5′－ATGGCCACCACCCTTCCC GT－3′；引物2∶5′－CAGTTGGTGGACCGGATCTG－3′；PCR扩增条件参照Cunimgham等文献。PCR产物用2%琼脂糖电泳在374bp处可见电泳带。

4．药物　小毛茛内酯从猫爪草块根中提取分离。

5．人PBL细胞的获得、体外培养和活化　56例标本随机分为7种体外培养组合设计。1为培养前；2为对照组（用RPMI　1640培养）；3为PHA；4为Tern（100mg／L）；5为PHA＋Tern（50mg／L）；6为PHA＋Tern（100mg／L）；7为PHA＋Tern（200mg／L）。每组8例。抽取外周静脉血5～10ml，肝素抗凝，用Ficoll－hypaque（Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden）分离PBL，用RPMI　1640完全培养液，调整细胞浓度至1×106个／ml，按研究设计加入相应的活化诱导剂；置37℃，5%CO2培养72h后高速低温离心，沉淀细胞作总RNA提取。

6．QC－RT－PCR检测GLS mRNA的表达

（1）主要试验和仪器：M－MLV反转录酶，RNA酶抑制剂，Taq DNA多聚酶，dNTPs，Oligo dT引物（Pro－mega），Thermojet EquiBio DNA扩增仪，凝胶分析系统（P．C gene公司）。

（2）QC－RT－PCR检测

①总RNA的提取：用Tr－izol RNA快速抽提试剂提取靶细胞总RNA（按试剂操作步骤）常规测定总RNA的浓度，A260／280比值均在1．80～2．0，－70℃贮存。

②引物序列：颗粒裂解肽（GLS）Sense：GGGAAGCTCCATA－AATGTCACCT，Antisense：TACACACAAGAGGGCCTC－CAGAGT；GAPDH（磷酸甘油醛脱氢酶，内参对照）Sense：GGTGAAGGTCGGTGTCAACG，Anti－sense：CAA－AGTTCGCATGGATGACC。

③RT－PCR反应：参照Chang J X等文献，反应参数为94℃1min，55℃30s，72℃30s，72℃7min延伸，共进行35个循环。为了控制每次RNA提取和PCR循环中的差异，每一样本体系同时扩增GLS和GAPDH的cDNA，产物分别为519bp和456bp的两条片段。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳。

④PCR产物半定量分析：电泳产物经EB染色后照相；并用凝胶图像扫描仪测两电泳带光密度值，计算每一样品GLS与其内参对照GAPDH比值的相对含量，单位用皮克（pg／μl）表示。

7．统计学分析　实验结果用x－±s表示，Spss　9．0统计软件的t检验比较组间的差异，多组之间用F分析。

（二）结果

1．结核病人PBL中结核菌16kDα－晶状体同源蛋白DNA的PCR检测结果　56例患者PBL的检测结核菌16kDα－晶状体同源蛋白DNAPCR反应产物2%琼脂糖电泳在374bp处可见清晰的电泳带。

2．Tern诱导结核休眠菌感染患者PBL体外GLSmRNA表达的QC－RT－PCR检测结果

QC－RT－PCR检测第1组至第4组血样本PBL GLS mRNA表达产物，电泳结果显示，体外培养前组和RPMI　1640完全培养液组未见明显的电泳条带；PHA或Tern活化组在519bp处均可见一清晰的电泳带，与预期的GLS基因片段长度相符。同时，在456bp处亦可见一内参GAPDH mRNA的扩增产物电泳带，说明GLS mRNA扩增结果的可靠性。

3．不同活化剂对结核休眠菌感染患者PBL体外GLS mRNA表达的影响　未加任何受试化合物的培养前组，与RPMI　1640培养72h后的PBL GLS mRNA几乎无表达，两者无显著性差异。单加入Tern，PHA或加入PHA＋Tern后培养PBL GLS mRNA表达产物的半定量分析结果显示，其3组的GLS mRNA表达水平与对照组相比有显著性差异（P＜0．01）。单加入Tern．GLS mRNA的表达水平偏低，与PHA组、PHA＋Tern组表达产物分别比较亦有显著性差别（P＜0．01）PHA组与PHA＋Tern组GLS mRNA表达产物比较，PHA＋Tern组水平显著高于PHA组（P＜0．001）。说明Tern具有诱导体外活化的PBL GLS mRNA表达的作用（表4－4）。

表4－4　不同刺激剂体外诱导GLS mRNA表达的结果（x－±s，n＝56）

结果用GLS（pg／μl）／GAPDH（pg／μl）比值×10－3表示；（1）P＜0．01υs对照组（用RPMI　1640培养）

4．不同剂量的Tern对结核休眠菌感染患者PBL体外GLS mRNA表达的影响　PBL在PHA体外活化后，当Tern浓度为50mg／L，100mg／L，200mg／L时GLS mRNA表达水平明显高于未活化的对照组，具有显著性差异（P＜0．01），但与单用PHA体外活化组比较，Tern 50mg／L无显著性差异（P＞0．05）。实验结果显示，低剂量的Tern不能诱导结核休眠菌感染病人PBL GLS mRNA的表达活性，Tern诱导活化的PBL GLS mRNA表达的作用呈剂量依赖性（表4－5）。

表4－5　不同剂量的Tern对GLS mRNA表达的影响（，n＝56）

结果用GLS（pg／μl）／GAPDH（pg／μl）比值×10－3表示；（1），P＜0．01υs对照组Tern　0mg／L（用RPMI 1640培养）

中药猫爪草煎剂对体外结核菌有抑制作用和治疗颈淋巴结结核有一定效果，本研究采用PCR方法检测结核病人PBLs中结核菌16kDα－晶状体同源蛋白DNA阳性的56例患者，采用反转录聚合酶链反应半定量（QC－RT－PCR）方法，测定不同剂量的猫爪草提取有效成分小毛茛内酯Tern对以上病人PBL颗粒裂解肽mRNA表达水平的影响，探讨了小毛茛内酯Tern抗人体结核休眠菌感染的分子免疫学机制，结果显示Tern在有效浓度时能诱导结核休眠菌患者体外活化后的PBL GLS mRNA高水平的表达，其表达产物与对照组比较有显示性差异。Tern对GLS mRNA的诱导作用呈现剂量依赖性，当Tern浓度达到100mg／L以上时，这种诱导影响方有显著性差异。由此得出，Tern可能通过促进颗粒裂解肽mRNA的表达，增强机体CTL杀菌能力，达到抗结核休眠菌的作用。结果尚提示：Tern可能是通过提高CTL的效应分子GLS mRNA表达的水平，活化CD8＋细胞，促进其以颗粒依赖的方式裂解感染了DTB的MΦ，而显示出抗菌作用。根据初步研究结果，Tern可望作为一种新型的内源性抗生素颗粒裂解肽的诱导剂，而用于治疗结核病。

关于结核休眠菌的实验指标及在不同对象中的阳性情况尚需进行更多的研究，以便为进一步探索抗结核休眠菌的分子免疫学机制提供依据。

宋文刚、孙玉芹等总结目前国内外抗结核分枝杆菌的中药种类及研究进展，结果认为猫爪草提取的有效成分小毛茛内酯（Tern）在有效浓度时能诱导免疫功能低下的结核休眠菌患者体外活化后的PBL GLS mRNA高水平的表达，随着GLSmRNA表达水平的升高和Ter培养时间的延长，结核菌16kDaSHSP表达却呈递减降低，提示，Tern可能一方面通过减少结核菌16kDaSHSP的表达，激活结核休眠菌恢复其对抗生素易感性；另一方面提高CTL的效应分子GLS mRNA表达的水平，活化CD8＋细胞，促进其以颗粒依赖的方式裂解感染了结核菌的Mφ，从而对休眠菌感染显示出抗菌作用．提示，Tern可望作为一种新型的内源性抗生素颗粒裂解肽的诱导剂，治疗耐药、多耐药结核病。