猫爪草醇提物对结核分枝杆菌临床分离株的可能作用靶标

（一）材料与方法

1．材料

（1）菌株和培养：结核分枝杆菌临床分离株。细菌在Middlebrook　7H9（Difco）添加OADC（0．5%牛血清白蛋白，0．2%葡萄糖，0．06%油酸，140mmol／LNaCl）的液体培养基中37℃培养。200ml Middlebrook　7H9培养基内接种总数为2×108的耐药结核分枝杆菌，37℃培养6～8d，至细菌密度为1×108／ml～2×108／ml或A600为0．8～1．0。

（2）主要仪器：等电聚焦电泳仪、Molecular ImageFx凝胶图像扫描仪、图像分析软件（Quantity One和PDQuest　6．0），PROREANⅡXL Box垂直板电泳仪均为美国Bio－Rad公司产品，U－3000分光光度计为HITACHI公司产品，质谱分析系统为美国Applied Biosystems公司的ABI　4700基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱仪（MALDI－TOF－MS）。

2．方法

（1）药物处理：将猫爪草75%乙醇浸提物浓缩后，每毫升相当于5g生药，处理终浓度为每毫升相当于1g生药浓度．将浓缩提取物加入培养至对数期的结核菌培养基中，处理30min后进行后续蛋白质电泳、抑制消减杂交（suppressive subtractive hybridization，SSH）和凋亡等分析。

（2）细胞蛋白样品的制备：4　000r／min，4℃离心15min沉淀细菌，用pH　7．4的PBS缓冲液洗涤沉淀细菌2次，用1ml PBS重新悬浮沉淀细菌并转入1．5ml EP管，1000r／min，4℃离心15min沉淀细菌，用1ml MilliQ水（含1mmol／L PMSF，10mmol／L EDTA）溶解，超声破碎裂解细菌15min，振幅70%，超声1min，停10s，缓慢加入尿素到超声裂解物至终浓度9mol／L，二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为70mmol／L．分别加入Bio－lyte和OG至终浓度为2%．样品置于室温中30min，间隔振荡，10000r／min，20℃离心30min，收集上清液，－70℃冻存，Bradford法测蛋白质浓度。

（3）双向凝胶电泳：第一向——固相pH梯度等电聚焦凝胶电泳，采用低电压胶内泡胀法，将30μl细胞蛋白样品360μl上样缓冲液（7mol／L尿素，2mol／L硫脲，4%CHAPS，65mmol／L DTT，2g／L Bio－Lyte，0．001%溴酚蓝）混合，加入样品水化盘中，放入17cm，pH　4～7的IPG胶条，加盖1～2ml液状石蜡，水化和等电聚焦按设置的程序进行，即水化50V12h，除盐250 V　1h，1000V1．5h，升压8000V5h，聚焦8000V，80000Vh。等电聚焦后的IPG胶条在平衡缓冲液（6mol／L尿素，2%SDS，1．5mol／L Tris－HCl pH　8．8，20%甘油）中平衡30min，转移至12%SDS聚丙烯酰胺凝胶的上端。第二向——SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），以每一胶条10mA恒流电泳30min，再加大电流至30mA直至溴酚蓝达到胶的底线，染色采用高灵敏度的银氨染色。

（4）凝胶图像的分析：凝胶用Molecular Image Fx凝胶图像扫描仪扫描，配比分析采用PDQuest　6．0软件完成。

（5）肽指纹图谱分析：样品切下放入样品管中，用25mmol／L碳酸氢铵溶液配制的50%乙腈溶液100μl脱色，真空冷冻干燥后加入0．01g／L胰蛋白酶10μl，4℃放置30min，37℃保温18h，再加入5%三氟乙酸溶液100μl，40℃作用1h，吸出上清液，加2．5%三氟乙酸溶液和50%乙腈溶液各100μl，30℃保温1h，吸出上清液，合并2次上清液，冷冻干燥，用10μl　0．5%三氟乙酸溶解冷冻干燥肽段，取1μl做肽指纹图谱分析。

（6）蛋白质序列数据库检索：根据肽指纹图谱搜索NCBI的冗余数据库（redundant data base），搜索限定条件为细菌，蛋白质分子质量为10～100kDa，等电点pI值为4～7，胰蛋白酶消化。

（二）结果

药物作用前后结核分枝杆菌临床分离菌株的2－DE图谱比较分析：用PDQuest软件对比分析药物作用前后的两张2－DE图谱，发现两者差异表达的斑点有22个，蛋白质分子量均处于10～100kDa，pI值分布于4～7，剪切其中差异明显的5个斑点，进行肽指纹图谱分析。

通过数据库搜索，结合2－DE图谱上相应蛋白质的分子质量和pI值，确定这5个蛋白质分别为：spot1，S－腺苷甲硫氨酸合成酶（S－adenosylmethionine synthetase）；spot2，吲哚－3－甘油磷酸合酶（indole－3－glycerol phosphate synthase）；spot3，烯酰－CoA水合酶（enoyl－CoA hydratase）；spot4，琥珀酰辅酶A合成酶（succinyl－CoA synthase）；spot5，60kD的分子伴侣2（60kD chaperonin　2），见表4－7。

表4－7　猫爪草处理组及未处理组的结核分枝杆菌蛋白质的表达差别

（1）积分＞70认为是有意义的

为研究猫爪草治疗耐药结核病可能的作用靶标，作用机制和有效成分，于2006年，西南大学生命科学学院联合复旦大学生命科学学院及上海市肺科医院等学者采用双向电泳（2－DE）技术结合基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱技术MALDI－TOF－MS），应用比较蛋白质组学的方法，来研究猫爪草醇提物对临床分离的结核分枝杆菌作用前后的蛋白表达差异，比较分析猫爪草提取物作用前后结核分枝杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达差异。

本研究采用双向电泳（2－DE）技术结合基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱技术MALDI－TOF－MS），应用比较蛋白质组学的方法，来研究猫爪草醇提物对临床分离的结核分枝杆菌作用前后的蛋白表达差异，比较分析猫爪草提取物作用前后结核分枝杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达差异。发现其中22个蛋白质斑点的浓度具有差异，利用基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱技术，对其中4个表达明显下调和1个明显上调的蛋白质斑点进行分析鉴定，获得5个明确的肽质量指纹图谱。通过数据库检索，确定这5个蛋白质分别为S－腺苷甲硫氨酸合成酶、吲哚－3－甘油磷酸合酶、烯酰－CoA水合酶、琥珀酰辅酶A合成酶和60kD的分子伴侣2，其中前4个分子首次报道参与结核分枝杆菌的重要生理活动。表明，猫爪草醇提物作用在结核菌的多条途径的多个靶标，这些途径包括氨基酸代谢及相关的多胺合成、脂肪酸代谢、中枢代谢途径以及可能参与蛋白质分泌、运输和免疫的分子伴侣，这与中药提取物多成分的性质相符。

上述结果是基于猫爪草醇提物对体外培养的结核菌的效应，有助于了解猫爪草醇提物对结核分枝杆菌生的影响。利用本研究获得的体外候选靶标建立高通量的筛选模型，同时分离鉴定中药各组分，寻找其对应关系，可能加速发现新结核病治疗药物的先导分子，蛋白质组学技术也是研究抗感染中药与致病菌药物靶标和组分的有效途径。