猫爪草不同提取物体内抗肿瘤作用的研究

（一）材料

1．受试药物及配制　猫爪草总提取物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位（自制）及水提多糖部位（由水提部位反复醇沉精制而得）。环磷酰胺（由上海华联制药有限公司生产　批号：20040125，规格：每支200mg）。氧化苦参碱（商品名：岩舒，由上海华联制药有限公司生产批号：20040125，规格：每支200mg）。氯化钠注射液（哈药集团制药六厂批号：030256）。吐温－80（天津市化学试剂工厂，批号：021112）。临用前总提取物及乙酸乙酯部位用含有10%吐温－80的氯化钠注射液溶解配制，其他部位则用氯化钠注射液配制成所需浓度，CTX配制成50mg／kg溶液，岩舒配制成50mg／kg溶液，现配现用。

2．实验动物及细胞株　动物：昆明种小鼠，雄性，体重（20±2）g，购自山东大学医学院动物实验中心，动物检疫合格证编号03－3001。瘤株：S－180及H－22荷瘤小鼠均购自山东省医学科学院药物研究所提供。

（二）方法

1．分组与给药　实验第0天，接种小鼠。在实验第1天，根据受试样品预实验结果，将小鼠随机分为受试样品高、中、低剂量组，阴性对照组（总提取物及乙酸乙酯部位以吐温－80组为阴性对照；其他组以生理盐水组为阴性对照），CTX及岩舒阳性对照组。每组10只小鼠，分别称重。分组后，CTX组，按50mg／kg体重，岩舒组，按200mg／kg体重，腹腔注射，每天1次，连续3d。受试样品组，按0．2ml／10g等容量不等浓度，灌胃给药，每天1次，连续10～12d。阴性对照组灌服相同体积的阴性对照液。

2．小鼠移植实体型肉瘤S－180模型建立及观察指标　无菌条件下，取传代1周的、生长良好的S－180荷瘤小鼠腹水，立即置无菌离心管中，以无菌生理盐水按1∶3比例稀释成瘤细胞悬液，离心管外周以冰袋来维持温度在4℃左右，以此来保持瘤细胞的活性。并计数调整细胞浓度为1×107／ml，用体重20g左右的昆明种小鼠162只，每鼠接种0．2ml接种于右前肢腋窝皮下（含瘤细胞数2×106个）。24h后称重并随机分成16组。每天观察小鼠的自主活动、眼睛和毛色及瘤体大小等情况，随时记录，瘤体重约1g时，停止给药。停药次日处死小鼠，分别称取小鼠体重，解剖瘤体、肝、肺、脾、胸腺，分别称重，个别组出现提早死亡的动物则提前解剖称重记录。计算抑瘤率、瘤／体比、肝／体比、脾／体比、肺／体比、胸腺指数和脾指数等。抑瘤率＝（C－T）／C×100%T为实验组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。

3．小鼠移植H－22肝癌移植瘤的模型建立及观察指标　无菌条件下，取传代后14d的H－22肝癌瘤源小鼠，脱颈椎处死，固定鼠板上，依次用碘酊、乙醇消毒其操作部位的皮肤，置于超净工作台中（事先以紫外线灯消毒30min）以无菌操作剥取肿瘤，选择生长良好无坏死及液化的肿瘤组织，剔除纤维包膜和坏死组织，在无菌平皿中剪碎，置组织于研磨器中，加入少量4℃生理盐水轻轻研磨，过滤，制成瘤细胞悬液，调整细胞浓度为1×107／ml，接种于近交系昆明种小鼠右腋窝皮下，每鼠接种0．2ml（含瘤细胞数2×106个）。接种后24h随机分组给药，分两组观察。一组于给药第11日处死，观察指标同肉瘤S－180模型，另一组停药后观察小鼠生存时间，计算生命延长率。

4．数据处理　结果均以（x－±S），数据统计分析采用SPSS　10．0for windows统计软件进行组间方差分析，判断有无显著性。

（三）结果

1．猫爪草不同提取物给药后小鼠精神状态情况　小鼠口服猫爪草不同提取物受试样品后精神状态有所差异，主要表现如下，见表4－11。

口服总提取物，给药1d后，自主活动稍有减少，随着剂量的增大程度加剧。中低剂量组动物于给药3d后恢复正常，高剂量组于给药1周出现腹泻，第8天出现死亡现象。溶剂对照组小鼠无异常情况发生：活动自如，正常饮食。口服乙酸乙酯部位，给药1d后，自主活动减少，随着剂量的增大程度加剧。高剂量组于给药5d后眼睛外凸、腹泻、毛发竖立、呼吸同时腹部随之抽动，不活动时，身体呈蜷缩状，给药1周出现死亡现象。中剂量组给药8d出现死亡现象，死亡时身体瘦弱、尸检未见脏器异常。低剂量组动物的活动、眼睛和毛色等情况于给药3d恢复正常。口服正丁醇部位，给药1d后，小鼠活动减少，随着剂量的增大程度加剧。于给药3d后恢复正常；高剂量组于给药8d后出现死亡现象。口服多糖部位，给药1d后，自主活动稍有减少，给药3d后恢复正常，所有剂量组均未出现死亡现象。

小鼠口服受试样品后的精神状态一方面反映对药物的敏感性（治疗作用），另一方面反映药物的毒副作用。综合以上现象可知，总提取物和乙酸乙酯部位的不良反应比较明显，主要表现在腹泻和眼睛外凸，其他两组尤其多糖部位不良反应相对较小。

表4－11　猫爪草不同提取物给药后小鼠精神状态情况

2．猫爪草不同提取物组对S－180小鼠瘤重的影响

（1）猫爪草总提取物组对S－180小鼠瘤重的影响：见表4－12。

表4－12结果显示，猫爪草总提取物不同剂量组对移植性实体型肉瘤S－180作用不明显，CTX组和岩舒组与阴性对照组比较均有显著性差异（P＜0．05，P＜0．01），同时从小鼠灌药前后数量减少和体重增减变化可看出，CTX组对小鼠有明显的毒副作用，总提取物组对小鼠无明显的毒副作用。

表4－12　猫爪草总提取物对S－180小鼠瘤重的影响（x－±S）

注：（1）表示与吐温－80组比较差异显著（P＜0．05）；（2）表示与吐温－80组比较差异极显著（P＜0．01）

（2）猫爪草乙酸乙酯部位对S－180小鼠瘤重的影响：见表4－13。

表4－13　猫爪草乙酸乙酯部位对S－180小鼠瘤重的影响（x－±S）

（1）表示与吐温－80比较差异极显著（P＜0．01）；（2）表示与吐温－80组比较差异显著（P＜0．05）

结果显示，猫爪草乙酸乙酯部位高、中剂量组对移植性实体型肉瘤S－180均有明显的抑制作用，抑瘤率分别为43．27%，35．06%，与阴性对照组比较有显著性差异（P＜0．05）；CTX组抑瘤率为86．54%，与阴性对照组比较有极显著性差异（P＜0．01）；岩舒组抑瘤率为30．68%，与阴性对照组比较也有显著性差异。同时从小鼠灌药前后数量减少和体重增减变化可看出，CTX组对小鼠有明显的毒副作用，乙酸乙酯部位高剂量组对小鼠也有一定的毒副作用，中、低剂量组毒副作用不明显。

（3）猫爪草正丁醇部位对S－180小鼠瘤重的影响：见表4－14。

表4－14　猫爪草正丁醇部位对S－180小鼠瘤重的影响（x－±S）

（1）表示与生理盐水组比较差异极显著（P＜0．01）；（2）表示与生理盐水组比较差异显著（P＜0．05）

结果显示，猫爪草正丁醇部位不同剂量组对移植性实体型肉瘤S－180均有明显的抑制作用，高、中、低剂量组的抑瘤率分别为45．71%，32．76%，21．64%，与阴性对照组比较有显著性差异，且抑瘤率与给药剂量呈一定正相关关系。CTX组和岩舒组的抑瘤率分别为80．54%，35．68%，与阴性对照组比较有极显著性差异。同时从小鼠灌药前后数量减少和体重增减变化可看出，CTX组对小鼠有明显的毒副作用，正丁醇部位无明显的毒副作用。

（4）猫爪草多糖部位对S－180小鼠瘤重的影响：见表4－15。

表4－15　猫爪草多糖部位对S－180小鼠瘤重的影响（x－±S）

（1）表示与生理盐水组比较差异极显著（P＜0．01）；（2）表示与生理盐水组比较差异显著（P＜0．05）

结果显示，猫爪草多糖部位不同剂量组对移植性实体型肉瘤S－180均有明显的抑制作用，高、中、低剂量组的抑瘤率分别为51．26%，49．93%，23．06%，与阴性对照组比较有显著性差异，其抑瘤率虽然随给药剂量而增加，但无明显的量效关系。CTX组与岩舒组，与阴性对照组比较有显著性差异。同时从小鼠灌药前后数量减少和体重增减变化可看出，多糖部位在抑瘤的同时，对小鼠无明显的毒副作用。

3．猫爪草不同部位组对H－22小鼠瘤重的影响

（1）猫爪草乙酸乙酯部位组对H－22小鼠瘤重的影响：见表4－16。

表4－16　猫爪草乙酸乙酯部位对H－22小鼠瘤重的影响（x－±S）

（1）表示与吐温－80组比较差异极显著（P＜0．01）

结果显示，猫爪草乙酸乙酯部位对H－22小鼠抑瘤作用随剂量增大而增强，呈明显量－效关系，但同时毒副作用也增加，表现在小鼠灌药后数量减少和体重减轻。高、中、低3个剂量组与阴性对照组比较均有显著性差异，抑瘤率分别为55．51%，45．10%，31．36%；CTX组与岩舒组，与阴性对照组比较有显著性差异，其抑瘤率分别为82．41%，47．74%。CTX对小鼠有明显毒副作用，乙酸乙酯部位高剂量组，也有一定的毒副作用。

（2）猫爪草正丁醇部位对H－22小鼠瘤重的影响：见表4－17。

表4－17　猫爪草正丁醇部位对H－22小鼠瘤重的影响（x－±S）

（1）表示与生理盐水组比较差异极显著（P＜0．01）；（2）表示与生理盐水组比较差异显著（P＜0．05）

结果显示，猫爪草正丁醇部位对H－22小鼠抑瘤制作用随剂量增大而增强，但无明显的量－效关系，高、中、低3个剂量组的抑瘤率分别为32．71%，25．08%，24．64%，与阴性对照组比较有显著性差异；CTX组、岩舒组与阴性对照组比较有显著性差异，其抑瘤率分别为95．37%，35．98%。同时从小鼠灌药前后数量减少和体重增减变化可看出，CTX组对小鼠有明显的毒副作用，正丁醇部位无明显的毒副作用。

（3）猫爪草多糖部位对H－22小鼠瘤重的影响：见表4－18。

表4－18　猫爪草多糖部位对H－22小鼠瘤重的影响（x－±S）

（1）表示与生理盐水组比较差异极显著（P＜0．01）

结果显示，猫爪草多糖3个剂量组对H－22小鼠均无明显的抑瘤作用，CTX组、岩舒组与阴性对照组比较有显著性差异，抑瘤率分别为95．37%，35．98%。同时从小鼠体重变化可看出，多糖各剂量组均有增加小鼠体重的作用。

4．猫爪草不同部位组对H－22小鼠生存时间的影响　见表4－19。

表4－19　猫爪草不同部位对H－22小鼠生存时间的影响）

（1）表示与吐温－80组比较差异显著（P＜0．01）；（2）表示与吐温－80组比较差异显著（P＜0．05）；（3）表示与生理盐水组比较差异极显著（P＜0．01）；（4）表示与生理盐水组比较差异显著（P＜0．05）

结果显示：小鼠移植H－22后，不同用药组存活天数差别相当大，生存期按长短顺序排列为：岩舒组＞多糖部位高、中剂量组＞正丁醇部位高、中剂量组＞乙酸乙酯部位中剂量组＞多糖部位、正丁醇部位低剂量组＞CTX组、乙酸乙酯部位低剂量组＞吐温－80组、乙酸乙酯部位高剂量组和生理盐水组。多糖、正丁醇部位均表现出明显的延长荷瘤小鼠生存期的优势，生命延长率均＞50%，与阴性对照组比较，有极显著性差异（P＜0．01），随着剂量增加其生存时间增长，但不具明显量－效关系。乙酸乙酯部位中、低剂量组对H－22小鼠的生命延长率分别为56．91%，45．09%，生存时间明显延长，与阴性对照组比较，有显著性差异（P＜0．05）；高剂量组不能使生存时间增长。

5．猫爪草不同部位对S－180小鼠肺、肝、脾及胸腺指数的影响　如表4－20所示。

6．猫爪草不同部位对H－22小鼠肺、肝、脾及胸腺指数的影响　如表4－21所示。

表4－20　猫爪草不同部位对S－180小鼠肺、肝、脾及胸腺指数的影响（±S）

（1）表示与吐温－80对照组比较差异显著（P＜0．05）；（2）表示与生理盐组比较差异极显著（P＜0．01）；（3）表示与生理盐水组比较差异显著（P＜0．05）

表4－21　猫爪草不同部位对H－22小鼠肺、肝、脾及胸腺指数的影响（－±S）

（1）表示与吐温－80对照组比较差异显著（P＜0．05）；（2）表示与生理盐组比较差异极显著（P＜0．01）；（3）表示与生理盐水组比较差异显著（P＜0．05）

表4－20及表4－21结果显示，由肺体比看出：小鼠移植S－180肉瘤、H－22肝癌移植瘤后，不同用药组肺体比差别相当大。肺体比最大的是CTX组，肺体比分别为15．24，15．34，具有明显的增加肺水肿的趋势，最小的是多糖部位低剂量组，分别为10．78，10．34，体现保护肺损伤、减轻肺水肿的趋势。同时，各部位高剂量组也有加剧荷瘤小鼠肺损伤和肺水肿的趋势，总提取物、乙酸乙酯部位的高、中剂量组的肺体比与阴性对照组比较，具有显著性差异（P＜0．05）。

由肝体比看出：小鼠移植S－180肉瘤后，不同用药组肝体比差别不是很大，肝体比最小的是多糖部位低剂量组，为54．16；最大的是CTX组，为68．31；其次是总提取物的高、中剂量组，分别为62．28，61．31，与阴性对照组比较，具有显著性差异（P＜0．05）。H－22肝癌移植瘤后，不同用药组肝体比差别比较大，肝体比最小的是多糖部位组，高、中、低剂量组分别为59．95，60．14，60．16，与阴性对照组比较，具有显著性差异（P＜0．05），说明多糖部位对肝具有一定保护作用，可减轻肿瘤代谢产物对肝的损伤、减轻肝大的趋势；最大的是CTX组，为66．32；其次是总提取物的高、中、低剂量组和乙酸乙酯部位高剂量组，分别为64．68，64．11，64．03，64．08，与阴性对照组比较，具有显著性差异，P＜0．05，说明对肝具有一定损伤作用，可加重肿瘤代谢产物对肝的损伤、增大肝大的趋势。

胸腺是一个重要的免疫器官，胸腺指数是用来检测机体免疫状况的指标之一。表4－20～表4－21可看出：CTX对机体免疫具有很强的抑制作用，小鼠移植S－180肉瘤、H－22肝癌移植瘤后，胸腺指数分别为1．53，1．62，与阴性对照组比较，有极显著性差异（P＜0．01）。而多糖部位组则有较明显的提高机体免疫作用，高、中、低剂量组分别为3．34，3．65，3．47，3．33，3．68，3．57。正丁醇部位高剂量组对H－22小鼠具有机体免疫抑制作用，胸腺指数为1．87，与阴性对照组比较，有显著性差异（P＜0．05）。

脾也是一个重要的免疫器官，脾指数的大小也往往反映机体免疫系统的功能状况，由表4－20及表4－21可看出药物对机体免疫系统的影响。CTX是临床上常用的免疫抑制药物，表4－21也证实了这一点，对S－180和H－22小鼠，脾指数分别为2．98，3．08，与阴性对照组比较，有极显著性差异（P＜0．01）；同时可知，多糖部位高、中、低剂量组分别为5．25，5．31，5．62，6．15，6．31，6．62，均高于生理盐水组，说明多糖部位对机体免疫系统有明显的调节作用，可显著提高荷瘤小鼠的免疫抑制状态。

（四）结论

1．本试验将猫爪草总提取物分割为石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水5个部位（见本章第一节），采用MTT和SRB两种方法，选用人肺癌细胞株A－549，人白血病细胞株HL－60及人宫颈癌细胞株Hela　3种瘤株，对5个部位进行全面的体外抗肿瘤药理活性的实验研究，结果证实，猫爪草正丁醇和乙酸乙酯部位具有明显的抑瘤作用，水提部位也有一定抑瘤作用。本节在前期体外实验基础上，重点对乙酸乙酯、正丁醇和多糖部位（水提部位精制而得）进行了多指标的体内抗肿瘤药理作用的研究。实验中建立S－180及H－22两种荷瘤小鼠动物模型，观察各部位的抑瘤率、生命延长率、肝／体比、肺／体比、胸腺指数和脾指数等，全面分析药理实验的结果，以确定抗肿瘤的有效部位。

2．综合以上实验结果，可得出以下结论。

（1）总提取物对移植性实体型肉瘤S－180及H－22肝癌移植瘤作用不明显。

（2）猫爪草乙酸乙酯部位：高、中剂量组对S－180均有明显抑瘤作用，抑瘤率分别为43．27%，35．06%。高、中、低剂量组对H－22小鼠抑瘤率分别为55．51%，45．10%，31．36%，均呈明显量－效关系。中、低剂量组对H－22小鼠生命延长率分别为56．91%，45．09%，生存时间明显延长；高剂量组不能使生存时间增长。高、中剂量组对S－180及H－22小鼠的肺体比分别为12．16，12．08，12．24，12．10，与阴性对照组比较，有显著性差异（P＜0．05）。高剂量组对H－22的肝体比为64．08，与阴性对照组比较，有显著性差异（P＜0．05），说明对肝具有一定损伤作用，可加重肿瘤代谢产物对肝的损伤、增大肝大的趋势。

（3）猫爪草正丁醇部位：不同剂量组对S－180均有明显的抑制作用，高、中、低剂量组的抑瘤率分别为45．71%，32．76%，21．64%，抑瘤率与给药剂量呈一定的正相关关系。对H－22小鼠的抑瘤作用随剂量增大而增强，但无明显的量－效关系，高、中、低剂量组的抑瘤率分别为32．71%，25．08%，24．64%；各剂量组对H－22小鼠均表现出明显的延长荷瘤小鼠生存期的优势，生命延长率分别为60．98%，59．76%，50．84%，随着剂量的增加生存时间增长，呈明显的量－效关系，高剂量组对H－22小鼠机体免疫具有抑制作用，胸腺指数为1．87，具有显著性差异（P＜0．05）。

（4）猫爪草多糖部位：不同剂量组对S－180均有明显的抑制作用，高、中、低剂量组的抑瘤率分别为51．26%，49．93%，23．06%，抑瘤率虽然随给药剂量而增加，但无明显的量－效关系。3个剂量组对H－22小鼠均无明显的抑瘤作用。高、中、低剂量组对H－22小鼠均表现出明显的延长生存期的优势，生命延长率分别为74．98%，74．76%，50．05%，随着剂量的增加生存时间增长，但不具有明显的量－效关系。低剂量组对S－180及H－22小鼠的肺体比分别为10．78，10．34，体现出保护肺损伤、减轻肺水肿的趋势。低剂量组对S－180小鼠的肝体比为54．16，高、中、低剂量组对H－22小鼠的肝体比分别为59．95，60．14，60．16，说明各剂量组对肝具有一定保护作用，可减轻肿瘤代谢产物对肝的损伤减轻肝大的趋势。各剂量组对S－180及H－22小鼠组具有较明显的提高机体免疫的作用，高、中、低剂量组的胸腺指数分别为3．34，3．65，3．47，3．33，3．68，3．57。对S－180及H－22小鼠，高、中、低剂量组的脾指数分别为5．25，5．31，5．62，6．15，6．31，6．62，均高于生理盐水组，说明多糖部位对机体免疫系统具有明显的调节作用，可显著提高荷瘤动物的免疫抑制状态。

本次实验结果表明，猫爪草乙酸乙酯、正丁醇部位和多糖等部位具有良好的体内抗肿瘤作用，但抗肿瘤作用的机制有所不同，对不同的瘤体细胞作用有所差异。乙酸乙酯部位3个剂量组对S－180及H－22瘤体实验动物既有明显的抗肿瘤作用又有一定的毒副作用，表现在小鼠灌药后数量减少和体重减轻。正丁醇部位对两种实验动物的抑瘤作用不及乙酸乙酯部位，但毒副作用较小。多糖部位对S－180瘤体动物的抑制作用强于乙酸乙酯和正丁醇部位，毒性作用也低于两者，但对H－22瘤体实验动物作用不明显，从免疫指标考虑，多糖部位具有明显优势，在同等剂量下，对移植性腹水型肿瘤H－22的生命延长效果也十分显著。同时，在实验中我们发现猫爪草乙酸乙酯部位在中剂量组对移植性肿瘤S－180及H－22表现出较好效果，而高剂量组生命延长均有所下降，且受试动物表现出较明显的泄泻、自主活动减少、毛色发黄、甚至掉毛、眼眶分泌物增多等毒性表现，这可能与猫爪草萃取部位中含有的成分较复杂，对实验动物既有明显的抗肿瘤作用又有较强的毒性作用有关。由此可见，对样品的进一步分离和纯化，利用高纯度的成分进行药理药效学实验，其结果更具科学性。