猫爪草有效部位的免疫活性

（一）材料

1．动物　昆明种小鼠，雌雄各半，50只，体质量（20±2）g，鸡红细胞和豚鼠血清。

2．猫爪草有效部位的提取

（1）多糖的提取：取猫爪草粗粉，依次用石油醚（60～90℃）、乙醚、95%乙醇提取，再用蒸馏水超声提取，合并水提液，浓缩，加入药用炭脱色，抽滤，滤液加入95%乙醇，使含醇量为75%，静置24h后抽滤，即得猫爪草粗多糖。

（2）皂苷的提取：取猫爪草粗粉，加5倍量的95%乙醇回流提取，回收乙醇至稠浸膏，用少量水溶出，再用石油醚萃取至石油醚层近无色，合并水相，用水饱和正丁醇萃取至正丁醇相淡黄色，再合并正丁醇相，用0．1%NaOH萃取至水相淡黄色，再用正丁醇饱和水洗正丁醇相至中性，减压干燥正丁醇相即得猫爪草总皂苷。

（二）方法

1．猫爪草有效部位对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响研究　取小鼠随机分组，每组10只，共5组，按0．2ml／kg灌胃给药，每日1次，连续7d，除空白对照组和多糖组外，均腹腔注射环磷酰胺（CTX）40mg／kg制备免疫低下模型。第7天每鼠腹腔注射5%的鸡红细胞生理盐水混悬液（0．2ml／10g），于注射鸡红细胞6h和最后1次灌胃2h后，脱颈椎处死小鼠，用酒精棉球消毒腹部皮肤，腹腔注射Hank液2．5ml，轻揉小鼠腹部，在腹膜上剪一小孔，吸出腹腔液后滴少许在载玻片上并推片，稍干后瑞氏染液染色，自来水冲洗，晾干，显微镜下观察，计算小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数，其中吞噬百分率＝（吞噬鸡红细胞的吞噬细胞数／100个巨噬细胞）×100%；吞噬指数＝100个巨噬细胞所吞噬的鸡红细胞数／100。

2．猫爪草有效部位对小鼠溶血素形成的影响研究　取小鼠按上述方法分组并给药，各组均于第1天每鼠腹腔注射5%的鸡红细胞生理盐水混悬液0．2ml进行免疫，于第7天给药后2h，小鼠眼眶取血，离心取血清，用生理盐水1∶100稀释后，取1ml与5%的鸡红细胞混悬液0．5ml，10%补体0．5ml混匀，另设不加血清的对照管，将混悬液充分混匀，在37℃恒温箱中温育30min，在冰水中中止反应，离心，取上清液于540nm处比色，以空白管调“0”点，测各管的吸收度。

3．猫爪草有效部位对小鼠外周血T淋巴细胞数的影响研究　取小鼠按上述方法分组并给药，于灌胃的第1天每鼠腹腔注射环磷酰胺（40mg／kg，0．1ml／10g），连续8d，另设空白对照组，腹腔注射并灌服同体积的生理盐水。于末次给药后1h，摘眼球取血推片，自然风干燥后，浸入孵育液（预热30min）中37℃孵育3h，自来水冲洗片刻（以冲洗沉渣为度），用滤纸吸干水珠，加1%孔雀绿溶液染色5～10s，自来水冲洗，滤纸轻吸，晾干后油镜检查。淋巴细胞核较大且呈圆形不分叶，染成绿色，胞质呈紫蓝色。T淋巴细胞胞质中呈现大小和数量不等的黑红色颗粒（一般2～5个），非T淋巴细胞的胞质中无颗粒。计数100个淋巴细胞，计算T淋巴细胞的百分比，比较给药组与空白对照组小鼠外周血中T淋巴细胞百分比的差异。

（三）结果

1．对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响　猫爪草多糖可明显提高正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数。而多糖、皂苷均能拮抗环磷酰胺所致的免疫抑制作用，且多糖疗效优于皂苷。结果见表4－38。

2．对小鼠溶血素形成的影响研究　猫爪草多糖能提高正常小鼠血清溶血素的含量。而且多糖、皂苷均能拮抗环磷酰胺对体液免疫的抑制作用，但是多糖效果比皂苷显著。结果见表4－39。

表4－38　各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能比较（n＝10±S）

与空白对照组相比，（1）P＜0．05；与模型组相比，（2）P＜0．05

表4－39　各组小鼠溶血素形成的比较（n＝10±S

与空白对照组相比，（1）P＜0．05；与模型组相比，（2）P＜0．05

3．对小鼠外周血T淋巴细胞数的影响研究　模型组T淋巴细胞百分比明显低于空白对照组。而各治疗组的T淋巴细胞与空白对照组比较均无明显差异，这说明猫爪草多糖、皂苷可以拮抗环磷酰胺对细胞免疫的抑制作用。并且多糖还对正常小鼠的细胞免疫有明显的增强作用。结果见表4－40。

表4－40　各组小鼠外周血T淋巴细胞数的比较（n＝10±S）

与空白对照组相比，（1）P＜0．05；与模型组相比，（2）P＜0．05

环磷酰胺为较强的免疫抑制药，对多种免疫活性细胞均有抑制作用。本研究采用环磷酰胺造模法制作免疫抑制小鼠模型，灌胃给药，观察和比较猫爪草有效部位（多糖、皂苷）对其腹腔巨噬细胞吞噬功能、溶血素形成以及外周血T淋巴细胞数的影响。实验结果发现，猫爪草多糖、皂苷可使吞噬百分率、吞噬指数显著升高；猫爪草多糖、皂苷可显著促进溶血素的形成并提高外周血中T淋巴细胞数。在影响小鼠非特异性免疫方面，猫爪草多糖可明显提高正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数，而对于免疫抑制小鼠多糖疗效优于皂苷。在影响小鼠特异性体液免疫方面，血清溶血素实验结果显示多糖和皂苷与模型组相比，在促进血清溶血素的形成上有显著性差异，说明这两种物质具有促进小鼠的血清溶血素生成的作用，但是多糖效果比皂苷显著。T淋巴细胞胞浆中含有非特异酯酶（简称ANAE）可水解α－萘酯，生成α－萘酚和醋酸根离子。前者可与六偶氮副品红耦联生成不溶性红棕色沉淀物，而B淋巴细胞缺乏此酶，故用酯酶染色可测出外周血液中的T淋巴细胞，配合前面两个药理实验结果，可以说明猫爪草多糖和皂苷均具有免疫兴奋的作用。可以认为是其有效部位，为临床应用和开发提供了实验研究基础。