表皮黑素细胞

人黑素细胞（MC）在妊娠5～6周自胚胎神经嵴开始移行（migration），第7周到达表皮。在胚胎移行途中，有少数成黑素细胞（MB）中途停滞或转化为无黑素静止MC。这些在胚胎发育中停滞或迷走MC看来似乎无意义，但最近研究发现毛囊外毛根鞘可能有少数多巴染色阴性静止的MC，它们能从外毛根鞘重新移行至脱色区表皮，积极参与白癜风色素脱失斑复色（repigmentation）。移行入表皮的MC最终定居在基膜上，每一个MC与其毗邻的大约36个角质形成细胞（KC）在形态和功能上密切关联构成表皮黑素单元。现在看来用表皮黑素单元来理解MC与皮肤其他类型细胞的联系未免过于简单，因为MC可能存在一个由未分化基底层KC、KC衍生细胞因子、基膜成分、细胞黏附分子和细胞外基质（ECM）等多种因素构成的特定复杂微环境中，其增殖分裂、黑素生成、移行和存活等行为可能会受来自这一局部微环境多种细胞或分子水平的调节，不利的环境因子（derogatory environmental factors）很可能诱导MC向皮损周边或毛囊移行，只有少数不能移行的MC才会成为各种机制（如免疫介导细胞毒或毒性氧自由基等）的靶细胞而遭破坏。Bose试图用这一观点来解释临床上部分白癜风患者白斑区周围皮肤出现的色素增加。诸多事实证明无论是胚胎发育中的MB，还是皮肤生理或病理状态下的MC均能发生移行，且移行机制很大程度上受到KIT／干细胞因子（SCF）系统、整合素／ECM系统的调控。

1．KIT／SCF系统

（1）KIT：鼠c-kit基因是一原癌基因被定位第5号染色体显性白斑（W）位点，编码一种有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，被称做KIT。人的KIT基因定位于第4号染色体q11～q13。c-kit基因在胚胎移行的MB高度表达，直到MB在皮肤定植发育（colonization）成熟。在成人正常MC也有一定水平c-kit基因表达。c-kit基因突变主要影响KIT受体细胞内ATP结合区，使受体自身特定区域酪氨酸的磷酸化障碍，阻断细胞信息传递。同时与细胞生长、分化、移行和存活有关的功能蛋白的磷酸化也有可能出现障碍。鼠c-kit基因突变出现斑驳病特征性表型（皮肤、毛发色素脱失），还伴有造血和生殖细胞生成障碍。在人类斑驳病中已证实有KIT基因突变，但并不伴有造血和生殖细胞异常。为了进一步研究c-kit对胚胎MB的移行、分化和增殖的作用，Yoshida等在小鼠交配后9．5～11．5天、13天、14．5～15天3个时期分别向胚胎内注射抗c-kit受体单抗（ACK2）以阻滞c-kit功能，结果得到3种皮肤着色模式完全不同的子代鼠。他们提出胚胎MB分化移行可能经历4个c-kit依赖和c-kit非依赖重复交替阶段：①皮肤内MB移行需要c-kit；②在MB进入表皮之前不需要c-kit；③进入表皮的MB激活增殖存活需要c-kit；④当皮肤的MC聚集并移入发育中毛囊后，其存活不需要c-kit。胚胎MC的c-kit依赖性调节呈独特的时空模式（spatio-temporal pattern），其机制仍不清楚。Spritz等人工合成KIT基因反义寡脱氧核苷酸在体外与正常人MC共同孵育，结果是该反义DNA链能显著抑制MC增殖，但对其存活无影响。KIT基因的反义寡脱氧核苷酸链可能通过与KIT mRNA结合，选择性地关闭KIT基因，阻止KIT受体蛋白的翻译，使KIT受体表达降低，从而抑制MC增殖。Norris等人发现正常成人MC也有一定水平KIT基因表达，这可能与保持正常MC的缓慢分裂潜能有关，KIT表达减少很可能会导致MC生长存活缺陷，成为白癜风皮损MC丢失的一个主要原因。此外KIT还能通过对酪氨酸酶蛋白磷酸化修饰，激活酪氨酸酶，促使黑素生成增加。

（2）SCF：SCF又称做肥大细胞生长因子，KIT配基和Steel因子。人SCF编码基因位于第12号染色体Steel位点。胚胎期SCF由皮肤成纤维细胞（Fb）表达产生。SCF作用具有多效应性（pleiotropic effect），它能延长细胞存活时间，影响细胞骨架装配，并通过调节MC表面整合素表达与整合素受体亲和力来调控MC在ECM配基上的黏附与移行。Scott等用人重组SCF对体外培养的人胎儿MC与新生儿MC进行干预，用时缩影像显微摄像（timelapse videomicroscopy）来记录两种MC在不同ECM包括纤维粘连蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）、Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原上的黏附移行情况，同时用流式细胞计荧光激发细胞分类技术（fluorescence-activated cell sorter）来分析细胞表面整合素表达。结果表明新生儿和胎儿MC对Ⅳ型胶原黏附减低；胎儿MC对LN黏附增加而对FN黏附减低；新生儿MC对FN黏附无变化，但在FN表面移行速度几乎提高两倍。整合素表达分析显示经SCF处理后新生儿MCα2下调；α3、α5、β1上调，胎儿MCα2、α5、β1下调；α5、β1下调；α3、αV上调。合理的解释α2是胶原、LN的受体，当新生儿MCα2下调可以说明新生儿MC对Ⅳ型胶原、Ⅰ型胶原、LN黏附减低；而α5β1、α3β1是FN的受体，这两种分子表达增加，使新生儿MC在FN表面移行增强。除直接调节MC整合素表达外，SCF还能通过影响其KIT配基酪氨酸酶活性来调节对整合素亚单位翻译后磷酸化，改变整合素受体亲和力。胚胎MB移行通路中Fb发育依赖性表达SCF，不断精细调节着MB对ECM的黏附分离平衡，正确引导和促使MB的移行，新生儿和胎儿MC对Ⅳ型胶原黏附减低有利于MB沿着富含Ⅳ型胶原的神经和血管基膜移行，胚胎MC对LN黏附增加，使细胞更易于定植在表皮基膜上。

2．整合素／ECM系统

（1）整合素：整合素是细胞黏附分子中一个复杂家族，它是由α、β亚单位经非共价键连接组成异二聚体的跨膜糖蛋白。目前已知至少有8个β和13个α装配成20多种整合素分子，其特异性通常是由α亚单位决定。参与皮肤细胞与基质相互作用的整合素见表2-2。整合素作为一个桥将ECM和细胞肌动蛋白骨架联结起来，联结的分子基础是β1和β3整合素胞内的C端肽链尾与细胞骨架相关蛋白，踝蛋白（talin）和α-辅肌动蛋白（α-actinin）相互贴附。整合素参与MC与ECM的动态黏着及诱导细胞骨架装配与拆卸（disassemble），与MC扩展移行密切相关。

表2-2　参与皮肤细胞与基质相互作用的整合素及其配基

注：VLA．晚期抗原；VCAM．血管细胞黏附分子；epiligrin．表皮整联配体蛋白；vWF．von Willebrand因子；TSP．血小板反应蛋白

Danen等用佛波酯对体外培养的人MC增殖与分化加以调控，并比较两种状态下的MC细胞黏附分子的特征，发现整合素表达有高度选择性。增殖态MC除能表达整合素外，尚有ICAM-1、E-钙黏素（cadherin）和CD44表达；而分化态MCα3β1、α5β1减少，α2β1、α4β1、α6β1增加，其他黏附分子不发生变化。由于MC很可能经α2β1、α6β1介导黏附胶原、LN，经CD44介导黏附透明质酸，经α3β1、α5β1介导黏附FN，经E-钙黏素介导黏附KC，因此增殖态MC对LN、Ⅳ型胶原黏附减低，对真皮FN黏附增加，但对KC黏附保持不变。当伤口愈合时，大量过渡性基质蛋白FN由KC和真皮Fb产生，因此增殖态MC对基膜（LN、Ⅳ型胶原）黏附减低，而对FN增加，MC很容易自基膜游离并在FN表面移行参与伤口愈合后皮肤色素恢复。Zambruno等用免疫电镜与免疫荧光方法研究了正常人MC在体内或体外整合素表达与功能情况，结果在体内完整表皮中MC仅发现整合素亚单位α3、α6、αV和β1存在，而体外分离培养MC则有α3β1、α5β1、α6β1、αVβ1二聚体存在。免疫荧光证实β1整合素均匀弥散分布在细胞表面，仅αVβ3簇集于灶性接触（focal contact）区。作者认为β1整合素主要介导MC黏附，β1、β3整合素共同介导MC移行，α5β1、αVβ3仅在培养MC存在，而体内表皮原位MC未见表达，提示这两种整合素对MC扩展和移行至关重要。

（2）ECM：ECM主要包括胶原、蛋白多糖和粘连糖蛋白。既往研究表明ECM不仅影响MC形态和数目，而且对MC运动及酪氨酸酶活性都有显著影响。Morelli等在体外系统评估了Ⅳ型胶原、LN、FN对MC运动的影响，结论是Ⅳ型胶原能增强MC移行，而FN、LN无此作用，Ⅳ型胶原这种介导MC移行增强作用，能被抗α2、α3亚单位单抗特异性阻滞。整合素介导的细胞黏附是通过其胞外区识别ECM基质蛋白特定的氨基酸序列和相邻细胞表面特定配基来完成。FN分子中部存在的RGDS序列（精-甘-天冬-丝）推测为α3、α5、αV三种整合素的识别位点。Scott等用人工合成的含RGDS序列的肽段来观察该肽段对MC贴附FN的影响，发现含RGDS序列的肽段对新生儿MC贴附抑制达85%，而对胎儿MC抑制为48%，提示新生儿MC主要是通过对FN的RGDS序列识别来完成贴附移行的。

3．MC移行与白癜风皮损复色　临床很早注意到PUVA治疗的白癜风患者白斑区复色首先是在毛囊周围出现一个色素岛，继而向外扩展融合成片，但从未发现整个皮损广泛渐进性复色。这种毛囊周围复色模式提示毛囊的MC很可能移行出来参与上述复色过程。Cui等人的研究支持这一观点，他们用扫描电镜和分离毛囊多巴染色（hair fol licle split-Dopa stain）技术证实在毛囊中下部外毛根鞘有多巴染色阴性未活化的MC，它们为表皮复色提供一个MC库（reservoir）。白癜风皮损区MC可能遭到破坏甚至完全丢失，但外毛根鞘未活化MC并不受影响。Norris提出外毛根鞘中下部MC移行至白斑区皮肤需要经过一个复杂的表皮环境。MC被紧密镶嵌在基膜上基底层KC间；MC周围的KC经半桥粒、锚丝、锚纤维束、锚斑块等结构牢固地固定在基膜上，KC间存在有桥粒、钙黏素介导的黏附；KC与MC间也有钙黏素黏附。新近还发现在MC与基膜界也存在有灶性接触或灶性接触样结构（focal contact-like structures）。MC如何自这一牢固的表皮环境中“逃脱”出来呢？有人提出可能是MC产生了特定的蛋白酶溶解掉现存的细胞连接，或通过与特定基质和细胞受体相互作用才能运动。Werb发现用含有FN的RGDS序列肽段来活化VLA-5整合素受体可诱导兔滑膜Fb细胞产生胶原酶和基质溶素（stromelysin）。而人MC通过FN分子片段是否也能诱导类似的金属蛋白酶产生，导致局部ECM重构（remodeling）以利于MC移行呢？目前仍缺乏证据显示MC在表皮基膜移行过程中能自泌蛋白酶。另一种导致MC移行的机制可能是细胞表面钙黏素转换，细胞表型的可塑性（phenotypic plasticity）变化会使MC更容易自表皮环境中游离。已有研究证实这一机制参与黑素瘤细胞转移与侵袭。Hsu等用双重免疫荧光技术研究了培养人MC与人黑素瘤细胞钙黏素表达，发现正常人MCE-钙黏素表达丰富，而P-钙黏素和N-钙黏素呈局限性表达（marginal expression），而黑素瘤细胞E-钙黏素表达下调，而N-钙黏素表达明显增加。E-钙黏素下调使MC与KC间黏附松弛，使MC更容易从周围KC调控环境中游离出来；而N-钙黏素表达上调，介导黑素瘤细胞相互黏附或介导瘤细胞黏附到真皮能表达相同N-钙黏素的Fb上，赋予瘤细胞转移与侵袭能力。PUVA治疗后皮损周围MC是否有E-钙黏素下调有待进一步证实。一旦MC自毛囊和皮损周围KC环境中移行出来，MC很可能通过与基膜的Ⅳ型胶原不断重复进行黏附和分离，沿着现存的基膜向白斑区滚动（rolling），MC移行到白斑区表皮后，必须进行分裂增殖以满足白斑区MC复聚（repopulation）对MC数量的需求。