（一）血浆游离血红蛋白测定
【原理】 血红蛋白具有类过氧化物酶的作用，能催化H2O2释放新生态氧，使邻甲联苯胺氧化，生成蓝紫色化合物。颜色深浅与血红蛋浓度成正比，在波长435nm进行比色，测定吸光度。通过计算，求得被检血浆中的血红蛋白的浓度。
【试剂】
1.2g/L 邻甲联苯胺溶液。
2.1%过氧化氢液。
3.10%醋酸溶液。
4.100mg/L血红蛋白标准溶液。
【操作】
1.静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的试管中，充分混匀，转速3000r/min，离心10min，分离血浆。
2.取3支试管分别作为标准管、测定管和空白管，按表9-3测定。
3.用分光光度计，波长为435nm，以空白管调零点，测定标准管和测定管的吸光度。
4.计算：
【参考范围】0～40mg/L。
【临床意义】正常情况下，血浆中血红蛋白大部分与结合珠蛋白结合，仅有微量游离血红蛋白。测定血浆游离血红蛋白可判断红细胞的破坏程度。血浆游离血红蛋白明显增高是判断血管内溶血的指征，蚕豆病、PNH 、阵发性寒冷性血红蛋白尿症、冷凝集素综合征、溶血性输血反应等明显增高；自身免疫溶血性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血可轻到中度增高。
表9-3 血浆游离血红蛋白测定的操作步骤
（二）血清结合珠蛋白测定（醋酸纤维薄膜电泳法）
【原理】待测血清中Hp与一定浓度的Hb溶液混合后，使之形成Hp-Hb复合物，在pH8.6条件下进行醋酸纤维薄膜电泳，待Hp-Hb与多余的未结合Hb分开后，剪下区带，洗脱，分别测定415nm吸光度，计算出Hp-Hb中Hb量，用以代表Hp含量。
【试剂】
1.30g/L血红蛋白液。
2.pH8.6 TEB缓冲液：55g Tris，17g EDTA，12g硼酸，用蒸馏水配成1000ml的贮存液。电泳槽缓冲液用前稀释3倍，浸膜缓冲液用前稀释6倍。
【操作】
1.取0.02ml的30g/L血红蛋白液与待检血清 0.18ml混合，置于37℃，20min。
2.用浸透TEB缓冲液的醋酸纤维薄膜，取上述混匀液20μl在离阴极1cm处点样，于电泳槽上电泳。电泳1h左右，清晰出现2条带为止。
3.取下醋酸纤维薄膜，剪下前面的Hp-Hb带和后面Hb带。分别用3ml等渗盐水洗脱，用分光光度计在415nm波长下测定吸光度。
4.按以下公式计算血清结合珠蛋白的含量。
【注意事项】
1.被检标本在采血和离心过程避免溶血，否则结果偏低。
2.血清结合珠蛋白检测，可与游离血红蛋白和含铁血黄素尿检测同时进行，用于溶血存在的实验室诊断，尤其是血管内溶血。
3.电泳后如只见1条区带，应将电泳后的膜纵剖1/2，分别用丽春红S和联苯胺染色，在Hp减少时，Hp-Hb带细小，颜色浅，丽春红染色才能见到。而用联苯胺染色可确定是否含血红蛋白。
【参考值】0.5～1.5gHb/L。
0.8～2.7g/L（火箭电泳法）。
【临床意义】
1.血清结合珠蛋白减低：见于各种溶血，尤其是血管内溶血。严重的血管内溶血时，Hp消失，在其位置的前面可出现一条高铁血红素白蛋白区带。
2.严重肝病、先天性无结合珠蛋白血症、传染性单核细胞增多症等Hp也明显减低，此时不能作为判断溶血指标。
3.Hp是一种急性时相反应蛋白，在感染、创伤、SLE、恶性肿瘤、妊娠、胆道阻塞等也会增高，此时Hp正常，不能排除溶血的可能。
（三）血浆高铁血红素白蛋白测定
【原理】高铁血红素与白蛋白结合形成高铁血红素白蛋白，后者与硫化铵形成铵血色原，用光谱仪观察结果，在558nm处有一条最佳的吸收区带。
【试剂】饱和硫化胺，乙醚。
【操作】
1.静脉采血4.6ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.6ml的试管中，充分混匀，转速3000r/min，离心10min，分离血浆。
2.取血浆或生理盐水稀释标本，以生理盐水作空白，用分光光度计从波长500～700nm描记吸收光谱曲线，如在620～630nm出现吸收峰，说明可能存在高铁血红素白蛋白。
3.取3ml血浆于试管内，滴加乙醚约1cm厚，然后加入1/10量的饱和硫化铵，振摇混匀，分层后取下层液用分光光度计从波长500～700nm描记吸收光谱曲线，如在620～630nm吸收峰消失，558nm处出现强吸收峰，证明存在高铁血红素白蛋白。
【注意事项】
1.血液标本要新鲜，并应同时做阴性对照。如溶血严重时，应用生理盐水稀释血浆。
2.为保证血浆无残留红细胞，应对血浆进行第2次高速离心。
3.高铁血红素白蛋白在620～630nm处有一吸收光谱，应与高铁血红蛋白区别。在加入过氧化氢后，高铁血红素白蛋白吸收光带不消失，而加入硫化铵后，该谱带消失而在558nm出现一新的谱带。
【参考范围】健康正常人呈阴性。
【临床意义】 阳性提示严重血管内溶血。
（四）尿含铁血黄素检查
见《临床基础检验》一书中内容。
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