（一）抗人球蛋白试验
【原理】抗人球蛋白试验（CoombS试验）检测自身免疫性溶血性贫血的自身抗体（IgG）。以检测红细胞表面有无不完全抗体的试验为直接抗人球蛋白试验（DAGT），检测血清中有无不完全抗体的试验为间接抗人球蛋白试验（IAGT）（图9-4）。
图9-4 抗人球蛋白试验检测原理示意图
【试剂】
1.抗人球蛋白血清：主要抗IgG。
2.正常O型混合比容红细胞：取2名以上的O型人抗凝血，离心去血浆，用大量生理盐水洗涤3次，离心得比容红细胞。
3.抗D血清。
4.AB型血清。
【操作】
1.直接抗人球蛋白试验
（1）受检者比容红细胞：取受检者抗凝血2ml，离心去血浆，用适量生理盐水洗涤3次，离心得比容红细胞。
（2）对照同型者比容红细胞：制作方法同上。
（3）取试管3支，按表9-4加入标本与试剂。
（4）将阳性对照管、阴性对照管水浴37℃1h，然后3支管均用大量生理盐水洗涤2次，制成20%红细胞悬液。
（5）取小试管4支，按表9-5加入标本与试剂。
（6）混匀，以转速1000r/min，离心1min后，观察结果，如阳性对照凝集，盐水对照及阴性对照均无凝集，表示操作及试剂均无问题。然后观察受检管，有凝集反应者为直接抗人球蛋白试验阳性，无凝集反应者为直接抗人球蛋白试验阴性。
表9-4 直接抗人球蛋白试验操作方法
表9-5 直接抗人球蛋白试验操作方法（续）
2.间接抗人球蛋白试验
（1）取出已分离的受检者血清、受检者比容红细胞与对照同型者比容红细胞（亦可用正常O型混合比容红细胞）和试剂，按表9-6操作。
表9-6 间接抗人球蛋白试验操作方法
（2）混匀，以转速1000r/min，离心1min后，观察结果：①如阴性对照和盐水对照不出现凝集，而阳性对照与受检者红细胞出现凝集为阳性结果，表示受检者血清中有不完全抗体，间接抗人球蛋白试验阳性；②如所有对照管与受检者红细胞均不凝集，不能判定为阴性结果，可能是抗D血清失效，应更换试剂；③如所有对照管与受检者红细胞均出现凝集，不能判定为阳性结果，用37℃生理盐水充分洗涤阳性对照的红细胞后重做。
【注意事项】
1.必须设定阳性对照、阴性对照和盐水对照。
2.在研究温抗体型自身免疫性溶血性贫血时，可选用单种特异的抗人球蛋白抗体（如抗IgG、抗IgA等），试验不仅能诊断自身免疫性溶血性贫血，还可对疾病进一步分型。
3.抗人球蛋白血清应新鲜，选择适当的稀释度和用量。
4.洗涤红细胞时要用大量的生理盐水，使红细胞洗涤充分，以免血浆球蛋白存在，中和抗人球蛋白而出现假阴性结果。
【参考值】直接和间接抗人球蛋白试验均为阴性。
【临床意义】自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、新生儿同种免疫性溶血性贫血、PNH 、药物性免疫性溶血性贫血等直接抗人球蛋白试验阳性，当抗体与红细胞结合后，有过剩抗体时直接和间接试验均为阳性。其他如结缔组织病、淋巴细胞增殖性疾病、传染性单核细胞增多症、某些慢性肝肾疾病等直接抗人球蛋白试验可出现阳性。
（二）冷凝集素试验
【原理】冷凝集素综合征的患者血清中存在冷凝集素，为IgM类完全抗体，在低温时可使自身红细胞、O型红细胞或与受检者血型相同的红细胞发生凝集。凝集反应的高峰在0～4℃，当温度回升到37℃时凝集消失。
【试剂】
1.2%正常人O型或与受检者相同血型的红细胞。
2.生理盐水。
【操作】
1.标本采集 抽取患者5ml血液，待血块收缩后，离心分离出血清。
2.血清稀释 取17支小试管，第l支试管内加入0.2ml受检者血清，第2～17支试管内都加入0.2ml生理盐水，并在第2支管内加入0.2ml受检者血清，并于混合后吸取0.2ml到第3支试管内，这样倍比稀释依次进行至第16支试管，第17支试管为生理盐水对照。
3.检测 以上每管加入2%正常人O型或与受检者相同血型的红细胞悬液0.2ml，混匀后冷藏（4℃）2～4h，立即观察结果，并记录下出现凝集的血清的最高稀释度。
【注意事项】患者血标本抽取后应立即放37℃水浴，不能放入冰箱，以防止冷凝集素被红细胞吸收出现假阴牲结果。
【参考值】健康人血清抗红细胞抗原的IgM冷集素效价<1:16。
【临床意义】冷凝集素综合征患者为阳性，效价可达1:1000以上。淋巴瘤、支原体肺炎、传染性单核细胞增多症、疟疾等可引起冷凝集素效价继发性升高。
（三）冷热溶血试验
【原理】阵发性冷性血红蛋白尿症患者血清中有一种特殊的冷反应抗体即D-L抗体(Donath-Landsteiner），在20℃以下（常为0～4℃）时与红细胞结合，同时吸附补体，但不溶血。当温度升至37℃时，补体激活，红细胞膜破坏而发生溶血。
【试剂】
1.补体：豚鼠血清于冰箱保存，临用时用生理盐水作1:10稀释。
2.生理盐水。
【操作】
1.标本制备 取受检者静脉血8ml。注入盛有小玻珠的小三角瓶内，轻轻摇动，制得去纤维蛋白血，分离血清，红细胞用生理盐水洗涤3次，并用生理盐水制得50%红细胞悬液。同样取与受检者同血型正常人血标本，做同样处理，制得正常人的血清和红细胞悬液。
2.检测 按表9-7加入各标本和试剂。
表9-7 冷热溶血试验操作方法
将各管先放冰箱冷藏30min，再放37℃水浴30min。
3.结果观察 转速1000r/min，离心10min，观察各管上层，有无溶血出现。第1管和第3管发生溶血而其余各管无溶血为阳性结果。
【注意事项】
1.应同时用正常人（第9管）作正常对照。
2.标本采集时，不能加抗凝药而用去纤维蛋白血。
3.试验设有各项阴性对照：正常人血清无D-J抗体、未加补体、患者血清经56℃温育30min灭活D-J抗体均为不能出现溶血的阴性对照。
【参考值 】健康正常人为阴性。
【临床意义】本试验是一种冷溶血抗体简易筛选试验，阳性见于阵发性冷性血红蛋白尿症患者，D-L抗体效价可高于1:40。病毒感染也可出现阳性反应。
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