异常血红蛋白检验

（一）血红蛋白电泳

血红蛋白电泳在异常血红蛋白的检出和珠蛋白生成障碍性贫血的实验室诊断中具有非常重要的作用。根据所用支持物不同，可分为纸上电泳、琼脂电泳、淀粉胶电泳和醋酸纤维素薄膜电泳等，其中pH8.5和pH6.5醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、省时、分辨能力较高、标本容易保存等特点，为实验室常用方法。

【原理】各种血红蛋白由于组成珠蛋白的肽链不同，不同的肽链含有不同的氨基酸，因此具有不同的等电点，在一定pH的缓冲液中带不同的电荷。在pH8.5的碱性缓冲液中，Hb带负电荷，向正极移动，其迁移的速度与所带电荷的强弱、分子量的大小有关，可在支持物中形成各种区带-电泳图，对电泳出的各区带进行比色或电泳扫描，可对各种血红蛋白进行定量分析，从而可初步发现各种异常Hb。

【器材与试剂】

1.微型电泳槽。

2.直流稳压电源。

3.浸膜缓冲液：①pH8.5TEB缓冲液：称取Tris 10.29g、EDTA-2Na 0.6g、硼酸3.2g，加蒸馏水至1000ml。②硼酸盐缓冲液：称取硼砂6.87g、硼酸5.56g，加蒸馏水至1000ml。

4.醋酸纤维膜：剪成6cm×4cm大小，或根据标本的数量剪成6cm长、不同宽度的膜。

5.染色液

（1）2g/L丽春红S染液：丽春红S0.2g，三氯醋酸3g，磺基水杨酸3g，加蒸馏水至100ml。

（2）联苯胺染液：取联苯胺0.1g溶于10ml的甲醇中，为贮存液。临用时取贮存液1ml，加入50ml醋酸钠缓冲液（乙酸1.2ml，结晶醋酸钠0.8g，加蒸馏水至500ml），再加入1滴30%过氧化氢溶液和1滴5%亚硝基铁氰化钠，混匀。

（3）氨基黑10B染液：氨基黑10B 0.5g，加甲醇50ml、乙酸 10ml，加蒸馏水至100ml；脱色液：甲醇45ml、乙酸5ml，加蒸馏水至50ml；透明液：无水乙醇70ml，冰醋酸30ml。

【操作】

1.制备约100g/L血红蛋白液　取肝素抗凝血3ml，750g离心10min，弃去血浆，再用生理盐水洗涤红细胞3次（500g离心5min），再1000g离心10min，得压积红细胞。加入等量的蒸馏水充分振摇，再加入0.5倍体积的四氯化碳，用力振摇，离心后，取上层液为Hb液备用。

2.浸膜　将6cm×4cm大小醋酸纤维膜浸入pH8.5TEB缓冲液，浸透后取出，用滤纸吸去多余缓冲液。

3.点样　用加样器吸取血红蛋白液2ul，垂直点加于醋纤膜（粗糙面）距一端1.5cm处。

4.电泳　将硼酸盐缓冲液作为电泳缓冲液倒入电泳槽内，将点样后的醋酸纤膜放于电泳槽架上，点样在阴极端，点样面向下。电压200～250V、电泳20～30min。同时用正常人标本做对照。

5.染色　①丽春红染色：将薄膜浸入丽春红染液中浸泡10min，移入3%～5%醋酸液中漂洗至背景为无色，贴于玻片上干燥后肉眼观察。②联苯胺染色：为证实电泳出的带是否是血红蛋白带，可用联苯胺染色。将电泳膜用100g/L磺柳酸溶液固定5min，充分水洗后，浸于联苯胺显色液中，至蓝色区带清晰显现后取出水洗，观察电泳结果，并与正常对照比较。③氨基黑染色：将已电泳的薄膜浸入氨基黑染液中，随时翻动，染色15min后移入盛有漂洗液的平皿中浸泡漂洗，更换漂洗液数次，直至薄膜洗净为止，取出待干后观察。

HbA2定量如下。

1.电泳　血红蛋白液的制备、浸膜、电泳同前。点样量为20μl。

2.染色　将电泳号的薄膜浸入氨基黑染液中，染色约30min，移入漂洗液中浸泡漂洗，更换染液次数，至背景干净为止（也可用丽春红染色）。

3.洗脱　分别剪下HbA、HbA2和与HbA2大小相当的空白带，放入试管内，再分别加入10ml、2ml和2ml的0.4mol/L的NaOH溶液浸泡，不时轻轻振摇，待血红蛋白完全洗脱下后，混匀。

4.比色　将以上洗脱液用空白带管调零，在波长600nm测定吸光度。

5.计算

式中5是HbA2管稀释多5倍。

【注意事项】

1.电泳时间不能太长，电泳时醋酸纤膜不能变干，故应观察到HbA和HbA2清晰分开就停止电泳，电泳时间太长区带反而扩散模糊。

2.点样量不能太多，如血红蛋白液太多，色带易脱落或染色不透，可出现HbA2相对增高的假阳性结果。

3.要避免Hb以外的标本污染薄膜，手指也尽量只触及膜的两端。

4.同时用正常人和必要的已知异常血红蛋白作血红蛋白电泳的对照。

5.温度低时，染色和漂洗时间应延长长。

【结果】 pH8.5TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳：正常人Hb电泳谱（图9-15）。最接近阳极端为HbA，HbF在HbA之后，但不易与HbA分开，其后为少量的HbA2，再后有两条为非Hb成分NHb1和NHb2。

图9-15　pH8.5TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳图

【参考值】

1.pH8.5TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳　正常血红蛋白电泳区带：HbA>95%、HbF<2%，HbA2为1.0%～3.1%。出现在HbA前方的一条异常血红蛋白区带即HbH带（β4），但HbF不易与HbA分开，HbH与Hb Barts不能分开和显示，应再选择其他缓冲液进行电泳分离。

2.pH6.5TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳　主要用于HbH和Hb Barts的检出。HbH等电点为5.6，在pH6.5TEB缓冲液中带负电荷，电泳时泳向阳极，Hb Barts则在点样点不动，而其余的血红蛋白都向阴极移动（图9-16）。

图9-16　pH6.5TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳图

【临床意义】

1.通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带。

2.β-珠蛋白生成障碍性贫血HbA2增加（>3.8%）、HbF增加（>30%），为β-珠蛋白生成障碍性贫血杂合子的重要实验室诊断指标。HbE病时也有HbA2区带位置处增加，但含量很大，在10%以上。HbA2轻度增加还可见于肝病、肿瘤和某些血液病。

3.α-珠蛋白生成障碍性贫血时HbH和Hb Barts增加。

（二）抗碱血红蛋白测定

【原理】HbF抗碱能力比HbA强，在碱性溶液中，HbF不易变性沉淀，其他Hb在碱性溶液中可变性沉淀，经过滤后取上清液于540nm处测定吸光度，可检测出HbF的浓度。本试验检测的是抗碱血红蛋白，除HbF外，Hb Barts和部分HbH也具有抗碱能力，需通过电泳鉴别。

【试剂】

1.0.083mol/L氢氧化钾或氢氧化钠溶液　经标定后置于聚乙烯瓶内，4℃保存，用时倒出少许。

2.酸性半饱和硫酸铵溶液　4ml硫酸铵饱和液加入等体积的蒸馏水，再加入10mol/L的盐酸液0.02ml。

【操作】

1.制备Hb液　与血红蛋白电泳检测相同。

2.碱变性作用　取3.2ml 0.083mol/L氢氧化钾或氢氧化钠溶液于试管内，（25±1）℃水浴中放置10min。加入0.2ml 100g/L血红蛋白液，立即计时，并迅速摇动。准确碱化1min时，加入6.8ml酸性半饱和硫酸铵溶液中止反应，迅速颠倒混匀六次，过滤后留取滤液。

3.比色测定　选择波长为540nm，以蒸馏水作空白管调零点，测定滤液的吸光度（A），再取5ml蒸馏水加入100g/L血红蛋白液0.02ml作为对照管，相同条件测定吸光度（B）。

4.按下式计算

式中51和251分别为测定管（A）和对照管（B）血红蛋白液的稀释倍数。

【注意事项】

1.每份标本要重复测定，以提高准确性。

2.红细胞在制备血红蛋白液前要充分洗涤，且血红蛋白液不能污染，否则可以出现假阳性。血红蛋白液应当天测定，否则会形成高铁血红蛋白，可被碱变性，使测定结果偏低。

3.碱液浓度和碱化时间、温度应准确。过滤后液体应1h内完成比色。

【参考值】2岁以上的正常人HbF<2%，新生儿可高达40%以上。

【临床意义】

1.HbF绝对增多　见于β-珠蛋白生成障碍性贫血，重型者达80%～90%。

2.HbF相对增多　见于急性白血病、淋巴瘤等、再生障碍性贫血、红白血病等。

3.HbF生理性增多　见于孕妇和新生儿期。

（三）HbF酸洗脱试验

【原理】HbF除抗碱能力外，其抗酸能力也比HbA强。在酸性缓冲液中，只有含HbF的红细胞不被洗脱，经伊红染色呈鲜红色。而其他含HbA的红细胞被酸洗脱，呈极淡红色。

【试剂】

1.80%乙醇。

2.pH3.3的酸性缓冲液　取24.6ml 0.2mol/L的磷酸氢二钠（35.81gNa2HPO4·12H2O溶于500ml蒸馏水）与75.4ml 0.1mol/L枸橼酸（9.6g无水枸橼酸溶于500ml蒸馏水）混合。

3.苏木素染色液　取1g苏木素溶于10ml无水乙醇中，取2g明矾研细后溶于200ml蒸馏水中。混合两液，煮沸后加氧化汞0.5g，再加热至染液变成深紫色，随即放入冷水中，使之冷却，次日过滤备用。

4.伊红染液　取10g/L伊红Y溶液200ml加入30μl冰醋酸。

【操作】

1.固定　将制备的血涂片自然干燥，用80%乙醇固定5min，水洗待干。

2.酸洗　将固定后血膜浸于37℃、酸性缓冲液中5min，水洗待干。

3.去除干扰　干燥后，在苏木素染液中染白细胞1min，去除白细胞的干扰。

4.染色　水洗后用伊红染液染色1min，水洗待干后，用油镜下计数1000个红细胞，求出阳性红细胞的百分率。

【注意事项】

1.血涂片制成后需2h内染色，否则可出现假阳性结果。

2.应严格掌握缓冲液的pH、温度和洗脱时间，以保证测定结果的准确。

【参考值】正常成年人含HbF的红细胞<1%，新生儿可占55%～85%，以后渐渐下降。

【临床意义】β-珠蛋白生成障碍性贫血患者着色细胞增加，重型患者大多数红细胞染色成红色，轻型患者可见少量染成红色的红细胞。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征全部红细胞均染为红色。

（四）异丙醇沉淀试验

【原理】非极性溶剂异丙醇能使Hb分子内部的氢键减弱，稳定性下降，正常Hb加到17%异丙醇溶液中，在40min以内不会浑浊。不稳定Hb则在5min时显浑浊，20min后会形成绒毛状沉淀。

【试剂】

1.pH7.4的0.1mol/L Tris缓冲液　取Tris 1.21g溶于少量蒸馏水中，滴加1mol/L Hb溶液调节pH为7.4，加蒸馏水至100ml。

2.17%（V/V）异丙醇缓冲液　取17ml异丙醇加入上述Tris缓冲液至100ml，充分混匀后，加塞于4℃冰箱保存。

【操作】

1.制备100g/L血红蛋白液（见血红蛋白电泳）。

2.于有塞的试管中加入17%异丙醇缓冲液2ml，在37℃水浴中预热数分钟。

3.加入新鲜制备的100g/L血红蛋白液0.2ml，混匀，加塞混匀后置于37℃水浴中并开始计时，分别于5min、10min、20min、30min观察。

4.结果：若放在37℃水浴中，5min出现浑浊，20min内出现沉淀，则为阳性。

【注意事项】

1.异丙醇浓度（17%）及预温时间要严格控制。异丙醇浓度浓度影响本试验的灵敏度。

2.标本为新鲜配制，因久置后血红蛋白可氧化成高铁血红蛋白而出现假阳性。

3.应用的血红蛋白浓度应控制在70～130g/L，最好为100g/L。

4.每批试验可取正常人血标本和脐血标本作阴性和阳性对照。

【参考值】正常人为阴性。

【临床意义】不稳定血红蛋白存在时常于5min时出现浑浊，20min开始出现绒毛状沉淀。在HbF、HbH、HbE含量高（>4%）时、G-6-PD缺乏症及α-珠蛋白生成障碍性贫血时可出现阳性结果。

（五）热变性试验

【原理】由于不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性产生沉淀，观察血红蛋白液在50℃时是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检。

【试剂】

1.0.1ml/L Tris缓冲液（pH7.4） 取Tris 1.21g溶于少量蒸馏水中，滴加0.1mol/L Hb溶液40ml，加蒸馏水至100ml。

2.氰化高铁血红蛋白转化液　NaHCO3 1.0g，KCN 50mg，高铁氰化钾200mg，加蒸馏水至1000ml。

【操作】

1.取新鲜配制的血红蛋白液（略见血红蛋白电泳）0.5ml，加入0.1mol/L Tris缓冲液5ml，混匀。

2.将上述液分别各取2ml加于2支试管内，一支试管（对照管）放4℃，另一支试管（测定管）置于50℃水浴2h后，将测定管置于转速3000r/min，离心20min。

3.取上述两管上清液各0.1ml，各加5ml氰化高铁血红蛋白转化液，混匀后，以0.1ml Tris缓冲液加5ml氰化高铁血红蛋白稀释液作为空白调零，波长为540nm，用分光光度计比色测定各管吸光度。

4.计算不稳定血红蛋白的含量：

【注意事项】

1.溶血液应新鲜，以避免假阳性结果。

2.严格控制温度和时间，如温度过高沉淀出现快，可出现假阳性结果。

3.离心要充分，取上清液时要小心，不能吸取沉淀的蛋白，否则结果减低甚至可出现负值。

【参考值】正常人热沉淀血红蛋白不超过5%。

【临床意义】血红蛋白沉淀增加，说明不稳定血红蛋白存在。本法敏感性不高，但特异性比异丙醇沉淀试验高。

（六）红细胞包涵体检查

【原理】不稳定血红蛋白易氧化变性沉淀，经碱性染料煌焦油蓝等活体染色后，被染色为大小不等、分散存在的蓝色颗粒。

【试剂】10g/L煌焦油蓝溶液：煌焦油蓝1g，枸橼酸钠0.4g，研磨溶解于100ml生理盐水中，避光保存，临用前过滤。

【操作】

1.取小试管一支，加新鲜血3～4滴，再加入0.5ml 10g/L煌焦油蓝溶液，混匀，加塞后置于37℃水浴，分别于10min、1h、3h和24h混匀后取一滴血推片，待干，备用。

2.油镜计数1 000个红细胞，算出含包涵体红细胞的百分率。

【参考值】正常人红细胞内无包涵体，呈阴性。

【临床意义】不同类型的不稳定血红蛋白所需孵育时间和形成变性珠蛋白小体的大小、形态、数量、分布可有不同。不稳定血红蛋白病多数在孵育3h后，红细胞内可出现变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵体；HbH病孵育1h就可出现变性珠蛋白小体。另外，G-6-PD缺乏症或红细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等红细胞中也可出现包涵体。

【注意事项】

1.观察结果时，须注意与网织红细胞鉴别，后者一般为网状结构，在10～15min即显现出来，而红细胞包涵体形成一般在10min至1h。

2.其他不稳定血红蛋白也可引起珠蛋白变性沉淀，形成变性珠蛋白小体，但需温育更长时间（3h或更长）。

3.制片后及时计数，否则放置过久变性珠蛋白小体可褪色消失。