（一）凝血时间测定
见本套教材《临床检验基础》一书
（二）活化凝血时间测定
【原理】静脉血加入鞣化酸-脑磷脂悬液，鞣化酸激活因子Ⅻ和Ⅺ，脑磷脂提供凝血反应的催化表面，启动内源性凝血系统，生成纤维蛋白，血液在试管内凝固，这一过程所用的时间即为活化凝血时间（ACT）。本试验提高了凝血反应的敏感性和重复性。
【器材】一次性灭菌注射器、内径8mm普通玻璃试管、37℃水浴箱、秒表。
【试剂】
1.抗凝剂：0.109mol/L枸橼酸钠溶液。
2.鞣化酸-脑磷脂悬液。
【操作】
1.准备 取内径8mm的玻璃试管3支，依次编号1、2、3。每管加入0.2ml鞣化酸-脑磷脂悬液。
2.采血 抽取静脉血3ml，并从血液流入针头开始计时，拔去针头，依次沿管壁加入1ml血液，置37℃水浴。
3.观察结果 水浴3min后，每隔30s轻轻倾斜第一管1次，直到倾斜试管血液不再流动为止，再依次观察第二管和第三管，以第三管凝固时间为最终结果报告。
【注意事项】
1.抽血顺利，避免混入组织液。
2.倾斜动作要轻，角度要小（约30°）以尽量减少血液与试管壁的接触。
3.试管的孔径要恒定，内径越大，凝固时间越长。
【参考范围】1min 42s±46s。
【临床意义】
1.ACT延长 内源性凝血因子缺陷或减少、血管性血友病（可检出因子活性<45%亚临床型血友病）、纤溶亢进；血液循环中存在抗凝物质，如抗因子Ⅷ、Ⅸ抗体，狼疮抗凝物质等。肝病、阻塞性黄疸、新生儿出血症等。
2.ACT缩短 见于血液呈高凝状态、血栓性疾病以及糖尿病血管病变、肾病综合征及妊娠高血压疾病等。
ACT可作为体外循环或血液透析时，肝素用量的监测指标，应维持ACT在350～450s为宜。
（三）活化部分凝血活酶时间测定
【原理】在受检血浆中加入鞣化酸作为激活剂，激活因子Ⅻ，用脑磷脂代替血小板第3因子，在Ca2+的参与下，观察血浆凝固所需的时间，即为活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）。本试验是内源性凝血系统较敏感和常用的筛选试验。
【器材】水浴箱、离心机、秒表、微量加样器、试管、血凝仪等。
【试剂】
1.0.109mol/L枸橼酸钠溶液。
2.APTT试剂（鞣化酸、脑磷脂）。
3.0.025mol/L氯化钙溶液。
4.正常对照血浆。
【操作】
1.标本采集和处理 静脉采血1.8ml于塑料试管中，加0.109mol/L枸橼酸钠溶液0.2ml抗凝，充分混匀，转速3000r/min，离心20min，分离贫血小板血浆。
2.测定 取小试管一支，加入待测血浆和APTT试剂各0.1ml，混匀，37℃水浴中活化3min。再加入预温的0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，混匀，并立即计时，置水浴中不断振摇。20s后，倾斜试管观察，记录凝固时间。再重复测定二次，取3次结果的平均值报告。
3.正常对照 用同样方法测定对照血浆的APTT值。
【注意事项】检测前应先测定健康人混合血浆，其APTT值在允许范围，否则，应重新配制试剂。
【参考范围】男性：31.5～43.5s；女性：32～43s。与正常参考值比较相差10s以上有临床意义。
【临床意义】同ACT，可检出因子活性<25%轻型血友病。可作为普通肝素抗凝治疗的监测指标，使APTT达到正常对照的1.5～2.5倍。
（四）凝血酶原时间测定
【原理】在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶试剂（含有钙、组织因子和磷脂），激活外源性凝血系统，使凝血酶原转变为凝血酶，后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，观察血浆凝固所需的时间即为凝血酶原时间（prothrombin time，PT）。本试验是反映外源性凝血系统最常用的筛选试验。
【试剂】
1.0.109mol/L枸橼酸钠溶液。
2.凝血活酶试剂。
3.正常人冻干混合血浆。
【操作】
1.标本采集和处理：同APTT。
2.正常对照测定PT：将凝血活酶试剂、正常人冻干混合血浆和待测血浆，分别置37℃水浴中预温5min。取试管1支，加入正常人冻干混合血浆0.1ml，37℃水浴预温30s，再加入预温凝血活酶试剂0.2ml，混匀，同时秒表计时。在明亮处不断地倾斜试管，液体凝固时停止计时，记录所需时间。重复测定2次，取平均值。
3.同样方法测定待测血浆的PT，重复测定3次，取平均值。
【注意事项】
1.采血避免溶血、泡沫和凝血块。
2.标本运送必须加塞，立即送检，2h内完成测定。
3.由于每次使用的凝血活酶活性不同，测定的条件也有变动，所以每次测定一定有正常对照。凝血活酶必须注明国际敏感指数（1S1）。
【参考范围】目前PT报告方式有下列几种。
1.直接报告测定时间，PT：11～13s。与正常参考值比较，相差3s以上有临床意义。
2.PT比值（PTR）报告：PTR＝待测血浆PT/健康人冻干血浆PT；PTR：0.85～1.15。
3.以国际标准化比值（international normalized ratio，INR）报告：INR＝PTRISI，ISI为组织凝血活酶试剂的国际敏感指数（international sensitivityindex，ISl）；INR：0.8～1.5。
【临床意义】
1.PT延长 常见于先天性或获得性外源系统凝血因子缺陷、原发性纤溶、血循环中抗凝物质增多。
2.PT缩短 常见于先天性因子V增多、DIC早期（高凝状态）、血栓前状态和血栓性疾病。
3.口服华法林等抗凝剂的用药监测 使PT维持在正常对照值的1.5～2.0倍，PTR维持在1.5～2.0倍，INR1.5～2.5为最佳。
（五）凝血酶时间测定
【原理】是在37℃条件下，待检血浆中加入标准化的凝血酶溶液后，观察血浆凝固所需时间，即凝血酶时间（thrombintime，TT）。
【试剂】
1.0.109mol/L枸橼酸钠。
2.凝血酶溶液：将冻干凝血酶先用蒸馏水适量复融，再用生理盐水调至使正常血浆在16～18s凝固。
3.正常对照血浆。
【操作】
1.标本准备：同APTT。
2.正常对照测定：将对照血浆0.1ml加入试管中，37℃水浴5min，加入凝血酶溶液0.1ml，立刻启动秒表，观察血浆凝固时间，重复测定2～3次，取平均值，即为正常对照的TT值。
3.待测血浆测定：方法同正常对照血浆。
【注意事项】
1.采血必须顺利，不得混入组织液。血浆在室温下放置不得超过3h。
2.已稀释好的凝血酶溶液应置于4℃保存，保存期为3d。
【参考范围】16s～18s，与正常参考值比较相差3s以上有临床意义。
【临床意义】
1.TT延长：见于肝素增多或类肝素抗凝物质存在，如系统性红斑狼疮、肝病、纤维蛋白（原）降解产物增多、DIC等。先天性或获得性低（无）纤维蛋白原血症、异常纤维蛋白原血症。
2.TT缩短：罕见，主要见于某些异常蛋白血症或巨球蛋白血症。
TT可作为溶栓治疗的监护指标，在使用链激酶、尿激酶溶栓治疗时，通过TT作为监护指标，以控制在参考范围的1.5～2.5倍为宜。
（六）凝血酶时间纠正试验
【原理】甲苯胺蓝可以中和肝素。如果受检血浆凝血酶时间延长，在待检血浆中加入少量的甲苯胺蓝，若延长的凝血酶时间恢复正常或明显缩短，则表示受检血浆中肝素或类肝素样物质增多，如果依然延长则为其他类抗凝物质或者是纤维蛋白原缺陷。
【试剂】0.1%甲苯胺蓝溶液。
【操作】
1.预温：取TT延长的受检者的血浆0.lml加入试管中，加0.1ml 0.1%甲苯胺蓝溶液，混匀后置37℃水浴中。
2.测定计时：加入标准凝血酶溶液0.1ml，记录血浆凝固的时间。重复测定2～3次，取平均值，即为纠正后的的TT值。
【注意事项】
1.待检血浆在室温下放置不宜超过3h。
2.纤维蛋白原过低，影响血液凝固，影响TT纠正时间。
【参考范围】待检血浆TT延长，甲苯胺蓝纠正试验缩短5s以上，提示待检血浆中含有肝素或类肝素样物质增多；否则TT的延长可能由其他原因所致。
【临床意义】血中类肝素物质增多，见于严重肝病、肝叶切除、肝脏移植、DIC等。
（七）血浆纤维蛋白原含量测定（Fg）
见《生物化学检验》
（八）血浆凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ促凝活性测定
【原理】将受检血浆分别与乏因子Ⅱ、V、Ⅷ、Ⅹ基质血浆混合（以确保除Ⅱ、V、Ⅷ、Ⅹ以外凝血因子正常），做血浆凝血酶原时间测定。将受检者血浆测定结果与正常人新鲜混合血浆比较（以确保所有凝血因子的正常），分别计算出各自的因子Ⅱ:C、V:C、Ⅷ:C和Ⅹ:C促凝活性。
【试剂】
1.乏因子Ⅱ、V、Ⅶ、Ⅹ的基质血浆。
2.0.025mol/L氯化钙溶液和生理盐水。
3.组织凝血活酶试剂。
4.正常人新鲜混合血浆。
【操作】
1.静脉采血1.8ml，0.109mol/L枸橼酸钠0.2ml 抗凝，制备贫血小板血浆。
2.绘制标准曲线：将健康人新鲜混合血浆以生理盐水作1:10、1:20、1:40、1:80、1:160倍比稀释（其中1:10相当100%的促凝活性），取各稀释标本0.1ml与基质血浆、组织凝血活酶试剂各0.1ml相混，置37℃水浴温育30s后，加入37℃预温氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。以凝固时间（s）为纵坐标，稀释标本浓度为横坐标绘成标准曲线。
3.患者血浆用生理盐水做1:20稀释后，以上述方法检测凝固时间，从标准曲线上查出相应促凝活性，乘以2为最终结果。
【注意事项】
1.乏因子基质血浆的乏因子相应活性小于1%，其他因子水平可正常。
2.受检标本应以枸橼酸钠抗凝，并立即分离使用。用-20～-30℃冰箱，则必须在1～2个月内检测，置-80℃保存可在3个月内检测。
【参考范围】因子Ⅱ:C 81%～115%；
因子V:C 72%～132%；
因子Ⅶ:C 86%～120%；
因子Ⅹ:C 84%～122%。
【临床意义】因子Ⅱ:C、V:C、Ⅶ:C、Ⅹ:C水平减低见于维生素K缺乏、DIC、肝脏病变（因子V:C除外）和口服抗凝药等。先天性上述因子缺乏较少见。血液循环中存在上述因子的抑制物。另外淀粉样变性和异常蛋白血症时可表现出Ⅹ:C下降；因子Ⅶ:C下降在肝病的早期即可发生；而单纯因子V缺乏是罕见的。
因子Ⅱ:C、V:C、Ⅶ:C、Ⅹ:C水平增高见于高凝状态、血栓性疾病和肝疾病。
（八）血浆凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ促凝活性测定
【原理】在受检血浆中分别加入乏因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ的基质血浆、白陶土脑磷脂悬液和钙离子溶液，记录各自的纤维蛋白丝出现所需时间，将测定结果与正常人混合血浆制成的相应标准曲线比较，找出对应的相当浓度来计算受检者因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ的促凝活性。
【试剂】
1.乏因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ的基质血浆。
2.脑磷脂悬液。用兔脑制备的脑磷脂冻干粉，应用时以生理盐水做1:100稀释。
3.5g/L白陶土生理盐水悬液。
4.0.05mol/L氯化钙溶液。
5.pH7.3咪唑缓冲液。甲液：咪唑1.36g溶于200ml蒸馏水中，加0.1mol/L盐酸74.4ml，加蒸馏水至400ml；乙液：0.13mol/L枸橼酸钠溶液；工作用的咪唑缓冲液以5份甲液与1份乙液混合而成。
6.健康人新鲜混合血浆。
【操作】
1.采静脉血1.8ml，0.109mol/L枸橼酸钠0.2ml 抗凝，制备贫血小板血浆。
2.空白管测定：取基质血浆、咪唑缓冲液、脑磷脂悬液及5g/L白陶土生理盐水悬液各0.1ml，混匀置37℃水浴2min，加0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录纤维蛋白丝出现所需时间。空白管所需时间控制在240～250s为好，必要时调整脑磷脂悬液的浓度。
3.标准曲线绘制：健康人新鲜混合血浆以咪唑缓冲液做1:10、1:20、1:40、1:80、1:160倍比稀释。各稀释度混合血浆0.1ml分别加入各种乏因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ的基质血浆0.1ml、已调整的脑磷脂悬液和5g/L白陶土生理盐水悬液各0.1ml，混匀，置37℃预温后，再分别加入37℃预温0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录纤维蛋白丝出现所需时间。以1:10稀释的标本为100%促凝活性，以稀释度对数作横坐标，所测定时间对数作纵坐标，在双对数曲上绘制标准曲线或计算回归方程。
4.受检标本测定：取受检血浆以咪唑缓冲液做1:20稀释，测定方法同上。以测定时间在标准曲线读出对应因子促凝活性值，乘以稀释倍数2，即为测定结果。
【注意事项】同血浆凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ促凝活性测定。
【参考范围】Ⅷ:C 77.3%～128.7%；Ⅸ:C 67.7%～128.5%；Ⅺ:C 71.7%～113.1%。
【临床意义】
1.因子活性减低 因子Ⅷ:C减低见于血友病甲、血管性血友病（尤其是I型和Ⅲ型）、DIC、因子Ⅷ抑制物的存在；因子Ⅸ:C减低见于血友病乙、肝脏疾病、维生素K缺乏症、DIC、口服抗凝剂和因子Ⅸ抑制物；因子Ⅺ:C减低见于因子Ⅺ缺乏症、肝脏疾病、DIC和因子Ⅺ:C抗体存在。
2.因子活性增高 见于高凝状态、血栓性疾病、口服避孕药等。
（九）凝血因子ⅩⅢ定性试验
【原理】在钙离子作用下，凝血形成的纤维蛋白单体聚合物在因子ⅩⅢ作用下形成稳定的纤维蛋白，不再溶于尿素溶液。如果受检血浆中缺乏因子ⅩⅢ，则纤维蛋白单体聚合物不能形成稳定纤维蛋白，可溶于5mol/L尿素溶液中。
【试剂】
1.0.109mol/L枸橼酸纳抗凝剂。
2.0.025mol/L氯化钙溶液。
3.5mol/L尿素溶液：尿素30g，加蒸馏水至100ml。
【操作】
1.受检血浆0.1ml，加入0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，混合后37℃水浴，30min。
2.尽量去除试管中液体，再加5mol/L尿素溶液5ml，置37℃水浴箱。
3.每2～4h观察1次，共24h。
【注意事项】加入5mol/L尿素溶液后，使凝块悬浮于溶液中，全部接触尿素。
【参考范围】24h内不溶解。
【临床意义】如24h内凝块完全溶解或部分溶解则提示存在因子ⅩⅢ缺乏。获得性ⅩⅢ缺乏主要见于原发性纤溶亢进、DIC、肝脏疾病、SLE、类风湿关节炎等。
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