遗传学基础

卵巢疾病遗传学是研究疾病的发生与遗传和环境之间的关系，检测和分析癌变过程相关基因的遗传学改变及机制，以及肿瘤类型和个体特征性的癌变遗传学途径。卵巢疾病遗传学的研究不仅可以为疾病的发生提供理论基础，也可以为卵巢恶性肿瘤的诊断和防治提供线索。

卵巢疾病的遗传学基础研究以卵巢癌领域多见，涉及一系列癌基因的激活和抑癌基因的缺失。肿瘤的发生一般有4～6个步骤，其分子遗传学通常包括至少2个癌基因的激活和（或）抑癌基因的缺失。

一、癌基因

在讨论癌基因之前，先介绍2个基因，即原癌基因和病毒癌基因。原癌基因是指控制细胞生长和分化的基因，它们在生物演化过程中高度保守，占人体全部基因数的0.1%～1%，是细胞的生长分化、个体发育、组织修补和生命所必需的。原癌基因偶尔被反转录病毒摄取和加工，变成急性转化病毒基因组中的一部分，即成为病毒癌基因。部分病毒癌基因偶尔在外界致癌因子的持久作用下，发生结构改变即突变，可引起异常的激活，演变成所谓的癌基因。

1.c-myc 原癌基因c-myc编码一种DNA结合蛋白，参与细胞生长调节，在造血系统肿瘤与一些实体瘤中，均已发现有cmyc的扩增，通常显示了肿瘤的侵袭性，但cmyc基因在卵巢疾病中扩增发生率相对较低，提示其未必引起卵巢疾病的主要分子学变化，不过发现瘤细胞的分化越差，c-myc的扩增发生率越高，提示c-myc可能与高度恶性的卵巢肿瘤的病理发生有关。

2.ras ras基因为癌基因中已被研究最多的一种，由ras编码的蛋白质依附于细胞膜表面，在细胞信号传导中起重要作用。

3.HER2/enu HER2/enu基因编码一种细胞表面的糖蛋白，这一蛋白的结构与表皮生长因子受体相类似，HER2/enu的过高表达与肿瘤的侵袭性有关，也与细胞固有的增值能力增强，以及对抗宿主的防御因素有关，例如肿瘤坏死因子等有关。在20%～30%的卵巢癌中发现有HER2/enu的扩增，这种扩增与预后有相关，扩增程度越高，预后越差，提示其可能作为一项预后标志。

二、抑癌基因

抑癌基因是指在细胞繁殖中起负调节作用的基因，其突变或缺失时，可促进细胞的肿瘤性转化。抑癌基因的突变或缺失可导致无功能的抑制蛋白的产生，而不能抑制肿瘤的发生。由于这些基因抑制细胞增殖，而非刺激细胞增殖，且一个抑癌基因引起细胞恶性转化须有两个等位基因失活，故也将这类基因称为隐形肿瘤基因。

1.p53基因 为含20 000个碱基对的DNA，包含了11个外显子，定位于17号染色体短臂（17p13）。基因组DNA长约20kb，编码一个393氨基酸的核磷酸蛋白。p53基因主要功能为调节细胞的生长周期，使受损伤的细胞停滞于G1期，使细胞有足够的时间修复损伤。p53具有调控细胞周期、诱导细胞凋亡、调节细胞的黏附与迁移、参与血管生成等作用。p53的功能异常主要通过等位基因缺失、基因突变、甲基化、表达缺失等方式发生。其中以突变最为常见，主要为体细胞突变。

p53基因的突变大部分发生在基因的保守区，相当于第5～8个外显子间，原本这部分序列编码的蛋白分子均具有重要的功能，点突变可引起个别氨基酸的异常替代，所产生的异常蛋白质产物可能对于细胞降解的抵抗性增强，p53半存期延长，因此在肿瘤细胞中p53突变显示为过度表达，p53蛋白增加。正常细胞中则仅含有野生型序列编码的p53蛋白，其含量很低。

2.p16基因 是1994年美国冷泉实验室Kamb等发现的新抗癌基因，这是一种细胞周期中的基本基因，直接参与细胞周期的调控、负调节细胞增殖及分裂。它定位于9号染色体的短臂，含3个外显子。p16基因产物涉及抑制细胞分裂周期中G1期至S期的转化、抑制CDK4对RB蛋白的磷酸化等。p16功能的丧失可以导致细胞生长失控。在许多不同类型的肿瘤细胞株中，例如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、膀胱癌、肾癌、卵巢癌和部分实体瘤中，p16的改变主要是纯和型丢失，也有点突变的发生和基因启动子的甲基化，导致p16基因的失活。研究还发现，p16可与其他抑癌基因如p53相互协同，共同抑制癌基因的表达。同时，p16可以特异性作用于CDK4，且易于标定，用它制成的抗癌药物具有专一性的靶目标，故将其导入肿瘤细胞中可能导致肿瘤细胞发生逆转，从而阻止肿瘤的发生发展。因此，p16在肿瘤基因治疗方面有着良好的应用前景。

3.BRCA1基因 BRCA1为原发性家族性乳腺癌-卵巢癌综合征的易感基因，定位于17号染色体的长臂，编码的蛋白约含1863个氨基酸。BRCA1的主要改变形式是点突变，它能从多个水平、多层次上通过多条信号转导途径抑制细胞增殖、细胞生长，阻滞细胞周期于G2PM期，诱导细胞凋亡，促进细胞终末分化，是一个重要的细胞周期负调控子。BRCA1亦是一种DNA损伤修复结合蛋白，能通过多条信号转导途径激活DNA损伤修复的调控点，参与DNA损伤修复，维持基因组的完整性，其突变和低表达是诱发乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌的主要原因之一。因此，了解BRCA1功能丧失的通路，对于建立可靠的预测试验和设计新的治疗策略颇为重要。

4.PTEN基因 是新发现的一种抑癌基因，其位于10号染色体的短臂（10q23），它所编码的蛋白质氨基酸序列和酪氨酸磷酸酶相似。目前已发现在多种肿瘤中存在PTEN基因的突变。PTEN基因突变使其失去了对细胞生长的负调控，从而导致肿瘤的发生。大量研究显示，在卵巢癌形成中，也存在PTEN基因突变，主要由点突变引起的。PTEN基因突变在9个外显子及部分内含子中均有发生，但突变主要分布在3个重要的功能区：第5个外显子的磷酸脂合成酶的核心序列及第7个和第8个外显子的磷酸化酶。

PTEN基因的杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）是杂合子同源染色体上的等位基因中，一个等位基因的部分或全部基因组序列的丢失，导致该等位基因不能表达。LOH在肿瘤细胞中是一种常见的DNA变异，抑癌基因的LOH会导致肿瘤的发生。许多研究表明，在卵巢癌中存在PTEN基因的LOH。PTEN蛋白具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶两种活性，能抑制丝氨酸/苏氨酸激酶Akt活性。进而上调细胞生长周期的激酶生长因子p27Kipl，干扰细胞生长信号，阻滞细胞于G1期，诱导细胞凋亡。吴卉娟等证实，PTEN基因是通过PI3K/Akt通路将信号失活的细胞存活，逆转对顺铂耐药的人卵巢癌细胞。

5.p27基因 又称Kipl，位于12号染色体短臂（12p13）。p27蛋白能结合和抑制环素/环素依赖性激酶复合物，阻断细胞周期的进程。p27基因已被认同为一个抑癌基因，在许多肿瘤中产生下调，并发现p27的表达与肿瘤的预后密切相关，其表达越少，预后越差。因此，p27有望成为一个新的肿瘤预后的标志。

卵巢肿瘤的发生、发展是一个多因素、多步骤、多阶段和多基因改变的过程。癌基因的激活和抑癌基因的失活，可使细胞生长和分化的调节失控，导致细胞基因突变、细胞异常增殖而发生癌变。

三、卵巢疾病的基因治疗

卵巢癌是恶性度最高的妇科肿瘤之一，由于手术和化疗的不尽如人意，基因治疗是当今肿瘤研究的热点。卵巢癌的基因治疗载体主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。其中，腺病毒载体转染效率较高，是目前基因治疗的主要手段和最有前途的载体。下面介绍几种卵巢癌的靶向基因治疗方法。

1.抑癌基因 p53基因是一类重要的抑癌基因，针对p53基因肿瘤靶向治疗已成为研究热点。已有研究证实，在肿瘤细胞内转导野生型p53不但能诱导肿瘤细胞停滞，促进其凋亡，抑制肿瘤血管生长，还能通过细胞转导和免疫调节功能发挥“旁观者效应”，杀灭肿瘤细胞。此外，转导野生型p53还能增加肿瘤细胞对放疗、化疗的敏感性。目前，研究发现重组人p53腺病毒（r Ad-p53）注射液能将外源性野生型p53导入卵巢癌细胞基因组，使其表达p53，将肿瘤细胞阻滞于G期，抑制其生长，促进其凋亡。r Ad-p53与顺铂联合应用疗效更加显著。

2.自杀基因 治疗的原理是将一些病毒或细菌基因组中的代谢酶基因导入肿瘤细胞，该基因编码特殊的转换酶，使某些对正常细胞无毒或低毒性的药物前体在肿瘤细胞中转变为杀伤毒素，从而特异性地杀死肿瘤细胞。目前，单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）/更昔洛韦（GCV）自杀基因系统和CD/氟尿嘧啶（5-FU）自杀基因系统研究较多。

HSV-tk系统由肿瘤特异性启动子（TSP）参与调控，无毒的前体药物GCV经HSV-tk表达作用后转化为有细胞毒性的磷酸化的GCV产物，从而抑制DNA酶活性及DNA合成，减灭肿瘤细胞。有研究发现，转染周期素依赖性激酶抑制剂基因（Cipl/Wafl）能增强SKOV3卵巢癌细胞的毒性。该系统不仅能杀伤转有TK基因的肿瘤细胞，对周围的未转导细胞也可通过“旁观者效应”，即转导细胞对非转导细胞的细胞毒作用，而起到杀伤作用。这显著增强了药物对肿瘤组织和细胞的效力。CD/5-FU系统有明显的“旁观者效应”，CD能使无毒性的5-FU经尿嘧啶磷酸核糖转移酶（UPRT）的催化转化为具有细胞毒性作用的氟尿嘧啶，不但能提高抗癌效率，而且可以降低FU对正常组织的细胞毒作用。联合使用两种自杀基因，利用其互补性，对卵巢癌可达到最佳杀伤作用。

3.RNA干扰（RNAi） 即基因封闭治疗，其原理是双链RNA（dsRNA）被特异的核酸酶降解，产生小干扰RNA（siRNA），这些siRNA与同靶的靶RNA互补结合。特异性酶降解靶RNA。从而抑制、下调基因表达。RNAi具有高特异性、高效性、可以同时抑制多种基因表达等优点，已发展成为靶向基因治疗的一种快速有效的方法。

Nick等研究发现，一种细胞信号分子p130cas在76%的卵巢癌组织中高表达，将p130cas基因的siRNA整合进入中性纳米脂质体（si-RNA-DOPC）中，和（或）紫杉醇联合作用，观测肿瘤生长及肿瘤细胞的增殖、凋亡活性。结果表明，沉默了p130cas基因的siRNA-DOPC通过促进肿瘤细胞凋亡和自发性死亡而抑制肿瘤生长。

4.多重耐药（MDR）基因 化疗是治疗卵巢癌的常用方法，但复发率较高。肿瘤多重耐药是指肿瘤细胞在细胞抑制药或细胞毒性剂存在时仍能生长存活。50%～70%的卵巢癌患者有多重耐药性。相应的基因MDRl编码P-糖蛋白（P-gp），P-gp通过与药物分子结合，经ATP水解提供的能量将药物排出细胞外，使细胞内药物浓度降低而产生耐药性。抑制MDRl的表达，不仅可以使肿瘤细胞内化疗药物浓度增加，也可以增加细胞对药物的敏感性。

Rein等证实，以腺病毒为载体的ADS/3MDRlEl对有化疗抗性的卵巢癌细胞有明显的溶瘤作用，与紫杉醇联合应用效果更加显著。

卵巢癌的耐药性可能是多基因共同作用的结果。在研究化疗耐药的卵巢癌细胞过程中发现了诸如蛋白激酶C（PKC）﹑Ⅰ型拓扑异构酶（topo-Ⅰ）、Ⅱ型拓扑异构酶（topo-Ⅱ）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）等基因的过度表达，对这些基因的研究可进一步了解卵巢癌耐药机制，并对治疗方法作出合理选择。

5.免疫基因 免疫治疗可以通过构建质粒或病毒载体表达目的基因，向肿瘤细胞或免疫细胞导入目的基因使机体产生免疫反应，提高肿瘤的免疫原性或机体对肿瘤的识别杀伤能力。诱导机体产生特异性的免疫应答反应。

免疫基因治疗可分为被动免疫基因治疗和主动免疫基因治疗。被动免疫基因治疗是通过基因转移使抗肿瘤免疫细胞产生细胞毒素，提高抗肿瘤能力。Weng等将基因修饰的肿瘤反应性T细胞用于治疗卵巢癌，并通过Ⅰ期临床试验证实了其安全性。已证实携带白细胞介素-24（IL-24）基因的一种基因治疗试剂重组ADV-NGN24l在Ⅰ期临床试验中对多种晚期肿瘤都具有作用。

主动免疫基因治疗是通过提高免疫原性较弱或无免疫原性的肿瘤抗原，激发体内自身的免疫反应。质粒DNA疫苗安全性高，但诱导免疫应答能力弱，为了增强疫苗的免疫原性，联合使用DNA疫苗和如IL-2及粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）等的细胞因子佐剂。

Anwer等给12例患者肿瘤内注射IL-12的DNA疫苗后，5例肿瘤缩小30%以上。病毒载体疫苗不但比DNA疫苗的表达量要高，还可以引起炎性信号。有效激发免疫反应，这些病毒载体疫苗包括直接注射病毒作为疫苗、自体肿瘤疫苗、T淋巴细胞疫苗和树突状细胞疫苗。

卵巢癌的基因靶向治疗具有针对性，应用前景广阔，但目前仍处在初步研究阶段，有诸多问题尚待解决，如分子靶向药物治疗的靶向性差、多鼠源性来源的抗体的异质性、突变及肿瘤信号转导的代偿性引起的耐药性、给药时间和顺序等；此外，靶向基因治疗也存在很多问题：载体转导效率低、临床试验结果不完善、安全性低、不良反应较多等。

卵巢癌的发生、发展是一个多靶点多环节调控的结果，且不同组织病理学类型的卵巢癌存在不同的分子异常机制，因此，需要更深入地了解卵巢癌癌变机制，在复杂信号通路中发现更多关键靶标，并根据不同亚型肿瘤分子病理，选择更有价值的基因靶向治疗。

（郝　敏　宁　佳　李　艳）