免疫功能紊乱的分子机制

目前有关机体严重创、烧伤后免疫功能抑制的发生机制主要有三种假说：抑制因子学说、抑制性细胞学说和神经-内分泌-免疫网络学说。

一、抑制因子学说

所谓免疫抑制因子泛指对机体免疫功能具有抑制作用的蛋白、多肽等物质，而本文所指的免疫抑制因子则特指在严重创伤（包括烧伤）后机体血清中出现的对机体免疫功能具有抑制作用的物质，目前有关其来源尚不清楚。解放军总医院第一附属医院的研究表明，其对免疫功能的影响似乎并非仅限于抑制作用。但为叙述方便，笔者仍沿用抑制因子这一提法。

关于血清中的免疫抑制物质的研究见于约50年前，Kamrin于1959年首次报道在正常人的血清中存在着某些能抑制细胞免疫和体液免疫的蛋白质。随后Moubray用离子交换柱层析法从牛血浆中分离出有类似作用的物质，其理化性质属“α-球蛋白”，并证实该物质能抑制抗体形成，延长移植皮肤的存活时间。1977年Hakim首次从烧伤病人血清中粗提出一种理化性质与白蛋白类似的物质，并认为其可刺激产生低分子量的蛋白质，或分子量低于10000的活性肽，并证实该提取物对正常人淋巴细胞转化和豚鼠巨噬细胞游走性产生抑制作用。国内黄文华等用巨丙烯酰胺凝胶电泳法证实，在严重烧伤病人血清中出现了大分子的异常蛋白带。

实际上，创伤血清中除上述的血清免疫抑制因子外，尚存在大量具有免疫抑制作用的物质，目前至少已发现有10类：①前列腺素类，主要以前列腺素E2（PGE2）为代表；②干扰素；③细菌蛋白；④烧伤毒素，关于烧伤毒素在20世纪50年代末就已有文献提及，人们对于烧伤后机体出现抵抗力下降的机制并不清楚，怀疑在烧伤血清中可能存在某种毒素，故称为烧伤毒素，但至今有关其理化性质仍不清楚；⑤变性蛋白，泛指因创伤或烧伤后由于机体代谢过程或由于机体受损组织产生的一类变性的蛋白物质；⑥可的松类激素物质；⑦中性粒细胞代谢产物；⑧组胺类物质；⑨血清蛋白质，有关其具体作用机制及理化性质目前还不清楚，相关资料表明，在正常机体血清中也存在一些具有免疫抑制作用的物质；⑩医源性物质，这类物质较多，如某些抗生素、麻醉药以及某些本身就具有免疫抑制作用的药物等。上述物质虽然也可造成机体免疫功能的抑制,但并非本文所涉及的创伤血清免疫抑制因子。

一般认为，创、烧伤程度愈重，其血清免疫抑制性亦愈强，40%以上的深度烧伤，其血清对正常机体的细胞免疫反应有明显的抑制效应。如将血浆予以置换，则血清免疫抑制性将大大减轻，甚至消失。显然，烧伤后血清中存在着对机体免疫功能具有抑制作用的物质。Ozkan从40%以上体表面积深度烧伤病人血清中提取出一种分子量介于1000～5000的免疫抑制活性肽（suppressor active peptides，SAP），并发现该抑制活性肽具有以下特点：①为蛋白质、脂类及多糖的复合物；②具有较好的稳定性，置于56℃、30min水浴处理不改变其抑制活性，且不为胰蛋白酶、DNA酶和RNA酶等灭活；③其抑制作用依赖于花生四烯酸代谢产物（主要为PGE2），当使用抗前列腺素等药物可减低其抑制作用；④对细胞无直接的杀伤作用。在创伤及大手术后病人的血清中也存在着低分子量的免疫抑制物（分子量为3500～8000）。

解放军总医院第一附属医院的研究也证实，当排除外源性感染和麻醉的影响条件下，在双后肢闭合性粉碎性骨折的家兔血清中发现了一分子量约为9000的异常蛋白，经初步分离后证实，该异常蛋白不仅对降低淋巴细胞的刺激转化、IL-2蛋白合成水平具有明显的抑制效应，而且其作用可通过减低IL-2mRNA的转录水平，抑制淋巴细胞IL-2的蛋白合成释放来实现。此外，该异常蛋白还对巨噬细胞的吞噬杀菌能力具有显著的抑制作用，然而，其对巨噬细胞合成和分泌PGE2、IL-1、肿瘤坏死因子（TNF）-α却具有刺激作用。显然，这种异常蛋白对机体的免疫功能并非呈单一的抑制效应。在以股骨骨折为主的严重创伤病人血清中笔者同样发现了类似的异常蛋白，其分子量亦为9000，随着创伤严重程度加重，该异常蛋白出现频率也越高，其出现往往预示病人的不良预后，而当去除该异常蛋白后，创伤病人血清的免疫抑制性则得以明显缓解。在动物实验的深入研究中发现该异常蛋白作用的独特性和复杂性，即它不仅具有免疫抑制作用，同时还对炎症介质的合成和释放具有刺激作用。事实上，在遭受严重创伤后机体的免疫功能呈现的是双向性功能紊乱状态，一方面表现为以淋巴细胞功能受抑为代表的抑制状态，另一方面又表现出以IL-1、IL-6、IL-8以及TNF-α过度分泌为代表的过度炎症反应状态。因此，有理由相信，这种仅在创伤后血清中出现的分子量为9000的异常蛋白是导致机体免疫功能紊乱的原因之一。

关于血清抑制因子或异常蛋白的来源目前尚不清楚，根据所报道的文献资料可以归纳为以下主要的4个方面，即来源于创面局部、内源性的免疫调节因子、外源性的异种抗原以及某些医源性因素。

（一）创面源性因素

早在1937年，Rosenthal即发现热损伤后的皮肤经体外一系列生化处理的提取物对正常小鼠具有毒性作用。1972年，Schoenenberger等采用250℃热铜板法对皮肤进行加压烙伤，随即剪碎致伤皮肤，以pH 8.6的Tyrode液提取、过滤、离心，取中层离心液通过硫酸铵盐析获得一组分子量约300000的脂蛋白复合物，推测为正常皮肤在热力聚合而形成的三聚体。体外实验表明该复合物对正常小鼠具有毒性作用，但遗憾的是对其免疫学效应未作深入研究。Sparkers等也从烧伤病人焦痂中提取出一种脂蛋白复合物，体外实验表明这种复合物对淋巴细胞增殖活化及合成IL-2水平具有较明显的抑制作用。此外，在烧伤创面使用某些药物，如硝酸铈（cerium nitrate），也能明显减少SAP的形成和释放。因而严重烧伤后，切除焦痂常可使患者全身情况明显缓解。以上资料表明烧伤焦痂中的确含有对机体免疫功能具有抑制作用的物质。因此，在Ozkan、Ninnemann等人从烧伤病人血清中分离出一组分子量介于4000～10000具有免疫抑制作用的SAP后，探讨其来源时首先考虑的便是烧伤焦痂。

上述资料均来源于对烧伤的研究，而血清免疫抑制物或异常蛋白并非仅在烧伤血清中出现，国外也有学者报道在钝性创伤或大手术后病人血清中也可分离出具有免疫抑制效应的物质。有人将大鼠背侧皮肤作一长约7cm的切口，发现其渗出液对免疫细胞具有抑制作用。显然并非只在热力作用下皮肤才具有产生免疫抑制作用的能力。为此，笔者建立了家兔双后肢闭合性粉碎性骨折致伤模型，在保持皮肤完整性的条件下从家兔血清中仍可分离提取出一种分子量为9000的免疫抑制性异常蛋白，同样情况也发生在严重钝性创伤病人，这说明血清免疫抑制性异常蛋白的出现与创伤严重程度有关，而与体表是否开放关系不大。

（二）外源性异常蛋白

所谓外源性异常蛋白主要指开放性损伤后，皮肤的屏障作用消失，外源性感染菌进入体内，在体内免疫防御系统的作用下形成的一系列细菌代谢产物或细菌毒素。烧伤、创伤、休克和大手术后外源性细菌的侵入，以及肠道细菌的移位是导致感染和脓毒症的直接原因，其中，铜绿假单胞菌和肠道杆菌是主要的致病菌。有研究采用层析法纯化大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙雷杆菌和沙门杆菌的内毒素，发现1.0ng/ml浓度的内毒素即可使正常人混合淋巴细胞反应和淋巴细胞转化发生明显抑制，并认为细菌毒素有可能是SAP的来源之一。然而，在创伤的早期阶段，血清即出现了异常蛋白。Ozkan的研究也证实，SAP最早可出现在伤后数小时内，而此时外源性细菌尚未在体内形成感染病灶，内源性移位菌所产生的内毒素含量微弱，对免疫功能的影响可能是次要的；但在创伤后期当细菌大量侵入体内并形成脓毒症后，细菌内毒素的免疫抑制作用则不容忽视。当采用闭合性创伤动物模型以避免外源性感染菌的侵入，同时给予适当的肠道抗生素以尽量控制内源性感染后，在动物血清中仍可见到免疫抑制性异常蛋白，显然细菌毒素并非创伤后血清免疫抑制性异常蛋白的主要来源。

（三）医源性因素

抗菌药物为严重创伤后特别是开放性创伤后的常规用药。Munster曾用植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）刺激淋巴细胞转化法观察了临床常用抗生素对淋巴细胞功能的影响，结果表明，林可霉素、四环素、红霉素等对淋巴细胞的增殖反应具有抑制作用。当前临床常用的抗生素其特点是作用广谱、杀菌或抑菌效果强烈，尽管目前尚未见到这些抗生素对免疫功能影响的系统报道，但可以推测，对细菌生长具有广谱、强烈的抑制作用则很难避免随之而来对免疫活性细胞活性的影响。现已证实，某些烧伤的外用药，如磺胺嘧啶银、磺胺米隆对白细胞的数量和趋化能力也有抑制作用。此外，巨乙烯吡咯烷酮过碘酸对混合淋巴细胞反应及PHA刺激的人淋巴细胞转化也存在明显的抑制作用，而丝裂霉素C则可增强免疫抑制性细胞的活性，导致机体免疫功能抑制。

创伤病人在接受手术的同时，也不得不接受具有抑制作用的麻醉药物。有人用化学发光法检测了常用麻醉药，如安氟烷、异氟烷对外周血多形核中性粒细胞的吞噬杀菌能力，结果表明，二者均有明显的抑制作用。此外，一氧化氮、乙醚、氟烷等可抑制正常人T、B淋巴细胞的增殖反应，苯巴比妥钠则可使小鼠抗体产生减少，Propofol可影响机体网状内皮吞噬系统的清除侵入感染菌功能。另有资料证实，静脉输注硫喷妥钠（thiopentone）、美索比妥钠（methohexital sodium）、依托咪酯（etomidate）后，可使外周血T淋巴细胞的刺激转化能力下降，从而降低淋巴细胞的免疫功能。Cabie对一组腹部择期手术的病人外周血单核细胞IL-1、TNF-α及IL-6的分泌能力进行了检测，结果显示术后1～2d IL-1、TNF-α分泌水平明显下降，手术2d后细胞因子分泌水平才有所恢复，他们认为静脉麻醉药的应用为其主要原因。由此提示，选择适当的麻醉药和麻醉方式，力图尽可能地避免或减少麻醉对机体免疫系统的干扰，应引起足够的重视。

在严重创伤病人的治疗中往往使用激素以减轻创伤后的应激反应，控制脑水肿或肺水肿等，但随之而来的是对免疫功能的显著抑制。反复多次输入库存血，也可导致机体免疫防御功能下降。由此可见，可导致免疫抑制的医源性因素较多，如何在考虑治疗方案的同时兼顾维护机体免疫系统的功能稳定性应为今后研究的重要课题之一。

（四）内源性调节因素

提到内源性调节因素，不能不涉及应激反应。应激是创伤产生的最基本也是最重要的反应，所产生的各种应激激素均可抑制免疫反应。在小面积的烧伤创面引流出的渗液中，可检测到较高水平的可的松和β-内啡肽。严重创伤后血中β-内啡肽含量也明显升高，可达正常5倍以上，至伤后4～5d后方逐渐恢复正常水平，而外周血淋巴细胞的增殖转化同时也出现类似的变化趋势。体外研究表明，内源性阿片肽类物质，如β-内啡肽、强啡肽等可对淋巴细胞及巨噬细胞功能具有抑制作用。因此，有资料报道对创伤病人使用阿片肽拮抗药，如纳洛酮（naloxone）可减缓病人的免疫受抑状态，改善病人预后。创伤后合成分泌增加的PGE2是目前研究较多的一种免疫抑制物，它主要由巨噬细胞分泌，为花生四烯酸类的代谢产物。淋巴细胞本身并不产生PGE2，但其胞膜上的PGE2受体与PGE2的结合，可使淋巴细胞功能发生抑制。在生理浓度下，PGE2即可使B淋巴细胞产生抗体水平下降，并可抑制对T淋巴细胞转化和克隆增殖反应，抑制E玫瑰花的形成和淋巴因子的产生，且对杀伤细胞的活化存在抑制作用。此外，PGE2还能刺激Ts细胞（CD8+）增殖，降低IL-2的合成。机体遭受严重创伤后，无论血中或是创面局部组织均检测到高水平PGE2，并伴随有明显的免疫功能抑制。当用环氧化酶抑制药吲哚美辛处理后，受抑的免疫功能可得到一定程度的缓解，但仍显著低于正常水平，由此提示关于血清免疫抑制因子的作用机制及来源仍需进一步研究。

除应激激素外，性激素也是影响免疫功能状态的重要因素。资料表明，雄性动物往往在严重损伤后易于出现免疫抑制，并发感染和脓毒症，而雌性动物则能保持相对稳定的免疫功能。伤前雄激素去势可减缓雄性动物的免疫功能受抑，如在伤后给予雄激素受体阻滞药氟他胺也可恢复受抑的免疫功能。对于严重创伤的患者，尽管在细胞因子的合成和释放方面，两性间未见明显差异，但并发脓毒症的患者，男性多于女性，绝经后的女性伤员，其表现也与绝经前伤员有较大差异。

为尽可能地减少其他因素对创伤血清免疫抑制性异常蛋白的影响，解放军总医院第一附属医院建立了在清醒状态下，家兔双后肢闭合性粉碎性骨折模型，在保持致伤部位皮肤完整性的同时，仅给予骨折部位的简单外固定，未予任何药物治疗。结果证实，随着动物致伤程度的加重（单后肢线形骨折、单后肢粉碎性骨折、双后肢粉碎性骨折），免疫抑制性血清异常蛋白的出现频率逐渐增高，在双后肢闭合性粉碎性骨折的家兔致伤后第2天，血清中通常均可见到分子量约9000的血清异常蛋白。由此表明，血清异常蛋白主要来源于机体针对创伤所产生一系列代谢反应的产物。同时也注意到，这种异常蛋白的出现与性别关系不大。由此表明，血清免疫抑制因子很可能是创伤后由于机体内环境的紊乱而特异产生的一种异常蛋白，有关其理化性质及来源和作用机制正在研究当中。

二、抑制性细胞学说

在创、烧伤免疫研究的早期，人们注意到某些具有免疫抑制活性的细胞，其细胞功能增强，甚至数量相对发生增多，于是推测损伤可活化抑制性免疫细胞，从而提出抑制性细胞的功能增强是导致免疫功能抑制的主要原因，最典型的表现即是CD8+淋巴细胞活性增强。现在看来这一认识是片面的。创伤后CD4+及CD8+的数量和活性较之正常均有下降，以CD4+下降更为明显，而CD8+的活性相对有所增强。因此，CD4/CD8比例的降低更有意义，但这种变化多发生于创伤后的中晚期，显然这只是创伤后免疫紊乱的表现之一。近来发现，除CD4/CD8比例变化外，创伤后 Th1细胞向Th2亚群的转化增加，当Th2细胞占优时，其所分泌的细胞因子，如IL-2、IL-4、γ-IFN等显著降低，有人认为这是导致T淋巴细胞功能抑制的主要原因。事实上，一组37例创伤病人的研究结果显示，其中发生T淋巴细胞功能无反应性的20例病人，IL-10与IL-2比例小于1，而另17例病人则大于1，这表明T淋巴细胞分泌的细胞因子及其调节网络的紊乱才是T淋巴细胞功能抑制的主要原因，而单纯对某一个或几个细胞因子的检测难以解释T淋巴细胞的功能紊乱现象。此外，不同部位的巨噬细胞也产生一些功能上的差异，使巨噬细胞人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）-DR表达受抑、吞噬杀菌活性减弱，但同时巨噬细胞分泌PGE2、IL-1、TNF-α等功能又明显增强，表现出典型的双相性功能紊乱。

三、神经-内分泌-免疫功能网络紊乱学说

应激是机体创伤后最本质也是最基础的反应，机体随后的变化都与之有关。目前对神经-内分泌-免疫网络的认识仅限于现象上的描述和理论上的推测。从细胞生物学基础看，免疫细胞表面具有多种内分泌激素和神经肽类的受体，如β-内啡肽、脑啡肽、P物质、糖皮质激素（glucocorticoid，GC）等，免疫细胞本身还可合成和分泌一些神经内分泌激素，如促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone，ACTH）、前体分子前阿黑皮素（pro-opiomelanocortin）、生长激素（growth hormone，GH）以及促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）等。此外，白介素及其他淋巴因子对神经内分泌激素的合成和释放也具有调节作用，如IL-1、IL-6；同样，很多神经细胞、内分泌细胞也可以分泌一些免疫活性因子，如ILs、免疫黏附分子等；另一方面创伤后大量神经内分泌激素的释放对免疫细胞的活性也存在抑制或促进作用，如β-内啡肽、ACTH以及促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）等对巨噬细胞或淋巴细胞功能均具有显著的抑制作用。目前尽管认识到神经-内分泌-免疫网络之间存在着密切的联系，但危重患者三者之间如何相互协调和影响，并最终给机体带来怎样的结局，由于研究手段的限制尚难以阐明。从经典的途径看，创伤后的应激至少可以通过CRH-ACTH-GC系统、交感-肾上腺髓质通路以及神经内啡肽的参与对机体产生影响。现已知，CRH、ACTH以及糖皮质激素对巨噬细胞的吞噬、抗原呈递功能以及对淋巴细胞的增殖和分泌IL-2作用具有较强烈的抑制效应。此外，β-内啡肽在体内外均被证实为一种具有免疫抑制作用的物质。创伤后应激激素的大量分泌从本质上是机体为防止更严重的损害的一种保护性反应，但在另一方面应激激素对免疫功能产生的抑制作用又使机体易于并发感染和脓毒症。笔者认为，神经-内分泌-免疫网络的紊乱是导致创、烧伤后机体免疫功能障碍的主要原因，有必要深入进行研究。