免疫状态监测及其意义

一、免疫监测的必要性

感染并发症依然是创伤、烧伤、大手术，特别是脓毒性休克的主要问题，在ICU中大部分急危重症患者发生感染与继发性免疫缺陷密切相关。事实上，医源性感染仍然是危重患者的主要并发症之一，可进而发展成为脓毒症，使患者的病死率明显增加。

正常情况下，免疫系统保持着高效和平衡，但是在发生严重的SIRS或脓毒性休克时，必然导致免疫功能严重紊乱。严重创（烧）伤、大手术或心肌梗死等可导致暂时性或不可逆性器官功能障碍，但在很多情况下，尽管存在器官功能失常或衰竭，由于监护仪器可动态监测多项重要器官的功能改变，故大部分患者经过积极处理得以生存。在发生严重的器官功能障碍或衰竭时，有很多方案可支持、纠正或替代这些失常的功能。然而，尽管免疫功能紊乱在MODS中占有重要的地位，但其作用很长一段时间内被忽视。与其他器官衰竭一样，尤其是脓毒症时出现免疫功能衰竭对于危重患者的生存产生极其有害的影响。

如严重创、烧伤等多种急危重症那样，导管监测或气管插管也可使患者天然屏障遭受破坏，进而明显增加了侵入性感染的可能性。此外，应激、炎症、病原体和年龄等因素同样也可以抑制天然及继发性免疫反应，因此应提前预防此类感染的发生。在过去的20年中，人们对SIRS和脓毒症的病理生理过程有了进一步的了解。大量实验数据表明，由细菌、真菌或其他微生物毒素诱导的过度炎症反应可能是SIRS、脓毒症和MODS的发病基础。因为应用TNF-α或IL-1β能够复制出与脓毒性休克相似的动物模型，因此最近几项试验尝试着中和这些炎症介质，但是结果令人失望。相应解释有多种，但从免疫学角度讲，在没有免疫监测的情况下进行免疫干预毫无意义。很多重症患者至少暂时表现为天然免疫或继发性免疫功能的丧失，被称为“免疫麻痹（immunoparalysis）”。

二、重症患者免疫状态的检测

机体抗感染免疫由复杂的天然及获得性免疫系统组成，对于预防微生物方面起着重要作用。在发生感染后数小时到数天中，天然免疫起着重要作用。T淋巴细胞因子包括IFN-γ能够放大天然免疫反应，参与了感染早期的机体防御反应过程。而当感染持续存在或出现机会性感染后，获得性免疫则发挥着重要作用。研究表明，在脓毒症期间特别是晚期阶段都存在单核细胞及粒细胞的失活，与血中快速循环或波动的细胞因子含量不同，细胞的表型则呈现稳定状态。此外，细胞因子的半衰期很短，而单核细胞或粒细胞离开骨髓后半衰期约24h。单核细胞在迁移向不同组织后分化成为不同类型的巨噬细胞；粒细胞生命短暂，发生炎症后也向炎症区域集聚。由于以上特性，可以把单核细胞或粒细胞的功能分析作为常用的检测指标。

在脓毒症过程中，常出现免疫功能的失常，表现为单核细胞分泌TNF-α能力下降，HLADR及CD80/86表达降低，同时抗原呈递能力的减弱。在这种状态下，机体至少暂时保持着产生抗炎因子IL-1ra和IL-10的能力，这些抗炎细胞因子的大量释放与机会性感染的危险性和患者不良预后有关。长期处于危重状况的患者极易发生感染，临床上免疫功能严重受到抑制（被称为免疫功能衰竭）是其主要诱因。事实上，在Volk等监测的1000多例重症患者中，如果单核细胞的HLA-DR表达及产生炎症因子功能不能恢复，则无一存活。他们最初在脓毒症器官移植受体患者中观察到这一现象，称之为“免疫麻痹”。另外一些研究也验证了其他几项指标的诊断意义。一般来说，免疫麻痹可定义为：①HLA-DR表达明显减少（<30%或<5000分子/细胞）；②抗原呈递能力下降；③产生促炎细胞因子的能力明显下降（全血受500pg/ml内毒素刺激后TNF-α产生<300pg/ml）。目前，常规工作中采用这些参数作为诊断依据的主要障碍是流式细胞仪应用及细胞因子检测的标准化程度较差。不同实验室有自己不同的标准，因此不同实验室得出的结果就难以进行比较。因为实行标准化是进行临床多中心试验的前提，因此有必要把改进标准化作为当前工作的主要任务，特别是HLA-DR及TNF-α检测的标准化问题。

Volk等应用半自动系统分析全血在低浓度内毒素刺激时产生TNF-α的能力（试剂盒包含标准化的培养试管、稀释液、内毒素及半自动TNF-α检测程序）。当用标准化很好的试剂检测中性粒细胞的相关参数时，试剂批内误差小于5%，批间误差小于20%。然而，在不同个体之间却有时存在较大的差异（低反应者与高反应者相差大于5倍），而中性粒细胞的表型却在一直保持稳定，显而易见这是由基因差异决定的。

检测方法要求用100μl肝素抗凝同时被稀释10倍的全血，在500pg/ml内毒素刺激后4h，判断免疫麻痹的标准为TNF-α分泌低于300pg/ml，而正常范围为500～2500pg/ml。样本处理需15min，得出结果总共需要5.5h。由于培养上清可在-70℃中保存，故不必多中心都拥有TNF-α半自动测量系统。故这种标准化良好的方法较容易应用于多中心的临床试验研究。

另一个衡量免疫反应功能的指标为CD14+单核细胞HLA-DR的表达。很多中心应用不同的抗体、流式细胞仪及不同的方案使相关数据之间很难进行比较。应用一种全新的细胞流式分析方法（Quantibrite HLA-DR，Becton-Dickinson公司）能够定量地检测CD14+单核细胞HLA-DR的表达。同时采用新的抗体标记技术及标准珠使得标准化过程减少了不少人为的因素，变异系数小于10%。若应用溶血素方法整个过程可少于45min。需要指出的是，使用EDTA抗凝对于防止分析前的影响很关键，定量分析HLA-DR的表达对于评价机体细胞免疫功能极为重要。

最近笔者采集了77例烧伤体表总面积大于30%患者血标本，通过流式细胞技术（使用QuantiBRITETM 抗HLA-DR PE*/抗单核细胞PerCP-Cy5.5单克隆抗体）对患者烧伤后1、3、5、7、14、21、28d CD14+单核细胞表面HLA-DR结合量进行动态的定量分析。结果显示，严重烧伤患者伤后第1天开始CD14+单核细胞表面HLA-DR结合量明显低于正常对照组，其表达均值与烧伤面积呈显著负相关（r=-0.7232，P<0.01）。并发MODS者CD14+单核细胞表面的HLA-DR表达量持续下降，其中伤后第3、14、21、28天显著低于非MODS组。随着CD14+单核细胞HLA-DR表达水平的下降，MODS发生频率增加，患者预后不良。说明大面积烧伤可导致机体CD14+单核细胞HLA-DR表达严重受损和免疫功能障碍，动态观察其定量表达水平有助于烧伤后MODS的病程监测及患者预后判断。

由此可见，目前至少有两种标准化的方法用于检测单核细胞的功能。另外，有些研究还提到了T淋巴细胞的功能失调。据报道，T淋巴细胞的功能抑制与危重患者不良的预后相关，T淋巴细胞的免疫障碍表现为IFN-γ/IL-4的比率失调。这种1型细胞因子与2型细胞因子的比例失调在CD8+T淋巴细胞亚群中尤为常见，存在免疫麻痹的脓毒症患者发生了Th1/Th2的极性化分化。但目前并不清楚T淋巴细胞的功能失常是创伤、应激或脓毒症的结果，还是不充分的抗原呈递所致，可能与两者均有关。