皮肤活力的鉴定方法

一、概述

皮肤经低温储存并经复温后，除非是完全坏死失活的皮肤，轻擦表皮就可和真皮分离，其他从外表上看，色泽、柔软度、弹性与新鲜皮差别不大。所以必须采用一些方法来监测其质量和活力，作为能否移植于病人的依据，也是进行皮肤储存研究工作的必要方法和手段。皮肤的生发层细胞及附件的细胞内存在许多酶，如琥珀酸脱氢酶（SDH）、乳酸脱氢酶（LDH）、酸性脱氢酶、Tween-60酯酶、细胞色素氧化酶、单氨氧化酶（MAO）、 吲哚酚醋酯酶（IAE）、磷酸化酶等。目前检测皮肤活力的方法很多，如用组织化学的方法对各种酶进行定性或定量试验，采用微型呼吸计测定细胞的氧耗，同位素标记法测定蛋白质或DNA的合成，光学显微镜或电子显微镜观察组织形态与细胞超微结构的改变，以及复原移植或细胞培养观察皮片成活率及细胞生长状态等。

二、琥珀酸脱氢酶测定法

琥珀酸脱氢酶（SDH）大部分存在于细胞的线粒体内，测定原理是SDH使琥珀酸脱去两个H形成延胡索酸，而这两个H作用于四氮唑蓝（blue tetrazolium，BT）还原形成蓝色颗粒双甲臢（diformazan）。结果显示有高度的SDH活性者呈蓝色，活性较低者呈红色，无活性者不着色。该方法快速简便，可作为皮肤保存方法选择及临床使用前活力判断的一种手段，但是其准确性不如定量试验。

Montagna（1962，1995）和Fromisano（1954）均指出，表皮基底细胞层SDH活性最强，胞质内充满表达酶活性的颗粒，其分布与线粒体一致，此颗粒在棘细胞层逐渐减少，在颗粒层很少。毛囊、汗腺、皮脂腺及其导管的SDH活性均很强，主要存在于基底细胞，而真皮的SDH活性很低。因此，皮肤SDH活性与其代谢和细胞增殖有关。琥珀酸脱氢酶主要功能是使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，是能量代谢三羧酸循环的一个重要环节。此酶含量的多少可以反映出细胞和组织的活力。测定的原理为：

测定的步骤为把皮片秤重，剪成小块，放入特制的桑氏管内，抽出空气，装入氮气。然后将桑氏管上端的试液（琥珀酸+红四氮唑）倒入，在37℃水浴中孵化1h，取出皮片。SDH使琥珀酸脱去的两个H原子，使红四氮唑（三苯四氮唑，2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）形成红色沉淀，即红色甲氮唑（formazan）。经乙二醇乙醚浸出4h后，将浸出液用波长490μm的分光光度计比色，读出光密度数（optimal density，OD），按OD/mg皮片重量计算出测定值及百分率，即可得出代表皮肤活力的数值。

新鲜皮肤SDH活力（X1）=OD/mg皮片重量

保存后皮肤SDH活力（X2）=OD/mg皮片重量

保存后皮肤SDH活性的百分率（%）=X2/X1×100

三、台盼蓝染色法

台盼蓝（trypan blue，TB）是一种细胞活体组织染色剂，又称锥蓝染色。具体方法是将要测定的皮片剪成小块，用胰酶消化成上皮细胞混悬液。吸入0.1ml加入0.1%台盼蓝液0.4ml混合后，在显微镜下观察100个上皮细胞。染有蓝色的为死细胞，不着色的为活细胞。数出活细胞数就可算出百分率。此方操作简便，不需特殊设备，1h就可得结果，但有时会有假阳性。

四、测定放射同位素标记掺入检测法

较常用的放射同位素标记物有3H-核酸、14C-亮氨酸蛋白、14C-葡萄糖、14C-甘氨酸蛋白和35S-硫酸钠黏多糖等。14C-亮氨酸掺入法是将以放射性同位素14C标记的亮氨酸作为示踪物，利用在表皮细胞蛋白合成代谢中，亮氨酸参与表皮片基底层细胞代谢增殖的状况，当与掺入的14C一起参与皮片蛋白质合成代谢时，测定其示踪的放射性含量，再计算出14C-亮氨酸的掺入量，能较好地了解到皮片细胞代谢情况及反映出皮肤活力的高低。

3H-尿嘧啶核苷（3H-UR）掺入法是将标记的3H-UR掺入后作为示踪剂，然后测定其表皮细胞内RNA的量，并观察蛋白质RNA合成代谢的状况，还可将3H-胸腺嘧啶核苷掺入以测定同位素与细胞内DNA的掺入率，当上皮细胞的活力减退时，则同位素的掺入率就降低。

上述同位素掺入的具体测定方法为：将要测定的皮肤标本用胰酶消化成上皮细胞混悬液，然后加入相应的同位素并蛋白掺入，或加入3H及相应的核苷以测定同位素与细胞内的RNA或DNA的掺入率，在37℃孵化一定的时间，再用三氯醋酸中止其反应，洗脱未与蛋白质结合的同位素后，将标本置于液闪的记录仪内，结合的放射性以dpm/mg组织表示，可以计算出该皮肤的活力高低。放射同位素标记掺入是一种较准确的皮肤活力测定方法，但因其同位素具有放射性，储存和运输不便，操作时易污染环境，需要专业人员操作以及专门的防护设备，且应用设备也较昂贵，不便于在基层医院推广使用。

五、皮肤氧耗量测定法

这是一种新型的电化学气敏分析法，其主要原理是有活力的组织均有代谢，所以要耗氧。在恒温的营养液内，与有活力的皮肤接触的微电极（铂、银电极）表面氧分压下降，可以通过放大器测出氧分压下降的程度，从而可以推算出皮肤的活力，操作过程可在1h内完成。测定值用kPa/60s表示，其测量值代表皮片的活力，测量值高者，皮片活力高，反之则皮片活力低。

六、皮块培养法

利用组织块培养的方法，对皮肤块进行培养观察，测量其在培养液中皮片向外生长的速度及面积，具体的方法是把要测定的皮片用锐刀切成小块，放入24孔培养皿内，然后加入组织培养液，在37℃的二氧化碳孵箱内培养。7d后如皮块周围有上皮细胞向外扩展生长，则证实测定的皮块具有活力，并根据皮块扩展生长的周径及时间，利用显微镜图像分析系统测量出其皮片生长的面积及速率。该方法需要专门的细胞组织培养技术与设备，培养时间周期长，适用于实验观察、研究之用。

七、皮片生物移植法

此法是临床中最直接可靠的皮片活力鉴定方法，无论是何种皮片及储存的方法，最终结果是以皮片能否在生物体内移植存活为鉴定标准。因此，这也是笔者当前烧伤创面治疗及皮片动物移植实验中最具体的生物学方法。它把要测定的皮片剪成小块移植于小鼠或大鼠的背部，5～7d后观察皮片成活的情况，如果皮片柔软，色泽转红，则说明具有良好的活力。也可用同样方法将皮肤移植于病人的供皮区，如果移植后4～5d，皮片转红，无水疱形成，则说明被测定的皮片具有100%的活力。但此方法不适合于临床救治大面积和深度烧伤病人切（削）痂覆盖创面。

八、四氮唑盐WST-1法

WST-1是体外合成的一种新型的细胞活化剂，其化学名称为4-[3-（4-碘苯基）-2-（4-硝苯基）-2-H-5四氮唑]-1，3-苯碘酸钠。它的作用原理是：利用体内具有活力的组织或细胞中的RS（线粒体琥珀酸四氮唑反应体系），作用在亚细胞的呼吸链反应中的NADH（还原型辅酶Ⅰ）、NAD+（辅酶Ⅰ）脱氢（H）反应与体内具有活力的细胞组织中的呼吸链EC（电子偶联反应体系）结合，将H结合到WST-1的甲氮唑苯环上，打开其四氮唑苯环而成显色反应，其反应底物变为甲氮唑。因此，只有体内测定的组织细胞具有活力，其变化的高低必然反映出上述体内亚细胞结构中的加H反应过程的多少，因而呈现出的甲氮唑成色反应也越重。可以根据这种成色反应来间接反映某一组织细胞活力的高低。该法简单易行、灵敏迅速，只需3～4h就可完成整个实验。具体方法为：取备用皮片，室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3遍，各实验组均检测8块直径为10mm的圆形小皮片。将小皮片分别置入96孔无菌塑料培养皿，每孔加入PBS 200μl，再加入WST-1 20μl。设立等剂量空白（未加皮片）对照组。置37℃的CO2孵箱内3h，弃去皮片，培养液置入双波长酶联仪，在450/690nm波长下测定OD值。实验组OD值减去对照组OD值，结果为皮片实测的OD值。

WST-1为水溶性细胞组织的活化剂，它较MTT、XTT和MTS的新型四氮唑盐的细胞活化剂更敏感、更稳定、无放射性、反应时间更短，不用漂洗及具有操作简便等特点，且价格低廉，已被国内大中型医院烧伤科皮库或有关的研究单位所采用。

九、SYTO/EB双重染色法

SYTO/EB活力测定方法为先将皮块切片，捞片后PBS洗3次，每次3min，滴加SYTO 13工作液50μl，37℃避光孵育20min，PBS洗3次，每次3min，滴加50μl EB（1μg/ml），在冰浴中避光30min。PBS洗3次，每次3min。然后在488/520nm波长光谱激发，Olympus荧光显微镜下观察细胞计数。荧光显微镜下活细胞发亮绿色荧光，死细胞发红色荧光，通过辨识两种颜色的细胞进行细胞计数，然后计算出活力的百分比。

SYTO/EB活力测定和WST-1活力测定方法的比较无明显差异。

SYTOTM核酸染色剂是一组新的穿透性核酸染色剂，该染色剂可穿透活细胞膜，与核酸DNA/RNA结合，在一定的激发和发射光谱下发出荧光。该系列各种染色剂之间在细胞穿透性、与核酸结合后荧光的增强度、激发/发射光谱和DNA/RNA结合活性特异性等方面有所差异，因此可以对多种细胞和细菌进行染色。研究SYTO与其他染色剂相比有许多特性：①用乙醇可将其从核酸上去除，但不能用氯仿和丁醇将其去除，这一点与EB和其他掺入性染色剂相反；②它与核酸的结合不受非离子去垢剂的影响；③因为它的结合方式与Hoechst或DAPI不同，因而不能被BrdU淬灭；④该系列染色剂均为阳性离子，因此与带负电荷的离子物质如核酸可以发挥最大结合活性。

而另外一种常用的染色剂EB也可以与核酸结合，但由于其分子量较大不能自由穿过细胞膜，只有在细胞死亡或细胞损伤细胞膜出现裂隙时才能进入细胞内，与DNA结合发出红色荧光。根据两种染色剂的特性，同时对皮肤组织进行双重染色，然后在一定的激发/发射光谱的激发下可以同时显示皮肤组织活细胞和失去活力细胞的分布。由于在荧光显微镜下两种染色剂所发出的荧光颜色不同，可以对两种不同颜色染色的细胞进行细胞计数，计算后即可得到皮肤组织的活力。

两种方法在机制上是有根本区别的，其中WST-1是一种间接测定法，以细胞内线粒体的呼吸功能来反映组织活力，代表了组织内各种细胞成分的活力总值。而SYTO／EB法可以从形态上直接观察到组织不同部位各种细胞的活力状态，因此能够对所需要部位的细胞进行活力的计算，在实际工作中可应用于特殊的实例。两种方法测定的活力值非常接近。SYTO/EB染色测定法整个过程只需1h左右，较WST-1法操作时间更短，而且结果敏感性与WST-1测定结果相近。另外该法的操作更为简便，只需一台荧光显微镜即可完成活力的检测，不失为一种敏感的、快速的皮肤活力检测方法。