皮肤低温储存后抗原性的变化

低温与其他外界因素一样对组织细胞有一定的刺激作用。研究表明，低温同样可以引起组织细胞发生各种各样的变化包括细胞膜、细胞器甚至细胞核的结构变化以及生物大分子如蛋白质、核酸的改变，从而对其功能造成一定程度的影响。抗原性来源于细胞膜表面的蛋白质上的抗原决定簇，一旦蛋白质各级结构发生变化，其抗原性势必受到影响。有研究证实，皮肤在低温储存后，在异体上存活的时间较新鲜异体皮肤长，其主要原因与经低温保存后皮肤抗原性的降低有关，而抗原性的降低与蛋白质的变化关系密切。

一、皮肤经不同温度低温储存后异体移植的比较

皮肤经低温储存后抗原性发生变化可以由动物移植皮片实验来证实，将不同温度储存的豚鼠皮片移植到小鼠身上，观察皮片存活日数（表6-1）。

结果显示存活日数由长到短依次为-196℃>-80℃>-20℃>-4℃>新鲜皮片，即保存的温度越低，皮片存活时间越长。另外病理组织学检查证实，在皮片移植早期对植皮床组织的炎性浸润，凡经低温保存的皮片移植组均较新鲜组轻，而且形态保持也较好。以上结果说明经低温保存后皮片的抗原性降低，保存温度越低抗原性越弱，移植后存活时间越长。

二、不同温度储存后皮肤蛋白质的变化

低温生物学认为，生物组织在<0℃环境中所受到的损伤主要来自水冻结后形成的冰晶引起的损害，低温本身的影响也不能排除。一方面由于水分冻结为冰晶，细胞内溶质浓度升高引起细胞的脱水，细胞发生皱缩造成细胞膜的损害，细胞内成分发生泄漏；另一方面，冰晶体是具有几何形状的结构，可以刺破细胞膜，引起细胞内成分的泄漏和细胞膜成分的丢失。另外低温可造成蛋白质超级结构内离子键的断裂，引起蛋白质结构的变化以至活性的丧失。

研究已经初步发现，皮肤低温储存后其蛋白质的成分、含量均有不同程度的降低，改变的程度与保存的方法有明显的关系。贾晓明等将人和豚鼠皮片分别用不同方法保存（4℃、-20℃、-80℃、-196℃），复温后制成匀浆，进行酯酶电泳分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（PAGE）。发现皮片经冷冻保存后，酯酶活性均有所降低，其中4℃保存的皮片酯酶峰值基本消失，-196℃降低程度最小；PAGE的结果与酯酶分析结果类似，低温保存的皮片蛋白成分均有变化，-196℃保存的皮片变化最小。考虑到经-196℃保存的方法是采用速冻玻璃化的方法，该法可避免在保存过程中组织细胞内水分的结晶，因此组织细胞可以免受冰晶形成所引起的一系列损害。因此，以上的实验结果表明皮肤经低温保存后蛋白质成分和活性均有所降低，其原因与冰晶的形成有直接关系。

三、不同温度储存后皮肤抗原性的变化

组织细胞的抗原性来源于蛋白质表面的抗原决定簇，蛋白质的任何变化均可影响其抗原性，特别是蛋白质超微结构的变化可能引起原有抗原决定簇的隐蔽，同时新的抗原决定簇也可能被暴露和出现；而蛋白质的降解则使抗原性大大减弱。

皮肤经低温储存后抗原性的变化与蛋白质变化的规律是相似的，笔者用人和豚鼠的新鲜皮片以及分别经4℃、-80℃、-196℃保存的皮片匀浆制成免疫血清，再分别用上述免疫血清与新鲜皮片匀浆，新鲜皮片免疫血清与各组皮片匀浆作火箭免疫电泳单相免疫扩散以及免疫火箭电泳分析。结果发现说明，经不同低温温度处理的皮片匀浆抗原性和量均较新鲜皮片由不同程度的降低，其中经-196℃保存的皮片降低程度最大，皮片抗原性降低的程度与储存温度是有直接关系的，其变化规律与蛋白质的变化相一致（图6-1，图6-2）。

图6-1　异体皮匀浆免疫火箭电泳图

上为新鲜皮片匀浆电泳结果，下为液氮储存48h后皮片匀浆电泳结果

图6-2　异体皮匀浆免疫扩散电泳图

右为新鲜皮匀浆电泳结果；左为液氮储存48h后皮片匀浆电泳结果

四、不同温度储存后皮肤朗格汉斯细胞（LC）的变化

朗格汉斯细胞是皮肤内介导免疫反应，引起同种和异种移植排斥反应的重要细胞。它的变化可以通过ATP酶染色计数法来观察。新鲜皮片表皮朗格汉斯细胞在光镜下清楚地显示出树突轮廓，胞体呈圆锥形或不规则形，每个细胞均有3～4个不同形态树突突起。贾晓明等观察了不同时间不同温度储存的异体皮内朗格汉斯细胞的变化（图6-3，图6-4），结果发现了以下的变化规律：①在低温下保存皮肤，朗格汉斯细胞计数均下降；②保存温度越低，朗格汉斯细胞计数下降越显著；③从朗格汉斯细胞数量降低的速率来看，-196℃保存的皮肤朗格汉斯细胞数量下降快、4℃的下降慢；④低温保存后皮片不仅朗格汉斯细胞的数量减少，而且形态结构也发生变化，残存的朗格汉斯细胞树突变短，消失，胞体变形。Abe等也发现经过深低温储存后的皮肤基底层细胞中的朗格汉斯细胞上S-100、CD1a等抗原的缺失，电镜证实朗格汉斯细胞虽然存在，但发生变性，细胞膜部分缺陷，细胞胞质内空泡形成。他们认为低温储存后朗格汉斯细胞的变性是低温储存后皮肤移植物存活延长的主要原因。

从以上的报道分析表明，朗格汉斯细胞对低温的刺激较为敏感，低温保存后皮肤抗原性的降低主要与朗格汉斯细胞的受损有密切的关系。