皮肤的玻璃化储存

一、玻璃化的概念及研究基础

（一）玻璃化的概念

早在1938年，Luyet就提出了玻璃化作为低温储存生物组织和细胞的方法，即将溶液以极快的速率降温冷却，由于降温速率很快，水分就没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃化状态，这样就可以减轻细胞内外冰晶对细胞的损伤。单纯应用加快降温速率来达到溶液的玻璃化非常困难，但随着抗冻剂在玻璃化过程中作用的研究进展，玻璃化储存逐渐应用于组织或细胞低温储存。

解放军总医院第一附属医院烧伤整形科从1987年就开始进行玻璃化储存皮肤的研究和临床应用工作。当时国内外尚未见有应用玻璃化法储存皮肤的报道。从动物实验及小规模临床应用证明其效果良好后，自1988年起，我单位已全部应用玻璃化法来储存异体和自体皮肤。此方法也已被国内众多单位推广采用。近年来也对玻璃化对皮肤细胞的影响，从不同角度进行了研究，并将这些结果应用到改进皮肤储存的实际工作中去。

（二）玻璃化对皮肤细胞功能和结构的影响

图6-3　新鲜豚鼠皮朗格汉斯细胞数量较多、呈树突状轮廓

图6-4　液氮储存7d后豚鼠皮朗格汉斯细胞数量明显减少，树突变短

1.玻璃化能减低冷冻对细胞膜流动性的影响　细胞膜是细胞的天然屏障，是细胞与外界进行物质交换、信息交流的场所，是维持通透性和跨膜转运稳定性的重要部位。低温损伤首先波及细胞膜，然后再引起细胞其他部位的继发性损伤。采用慢冻法保存时由于降温速率较慢，细胞膜脂质发生结晶，易产生膜相分离，引起对细胞的损伤。笔者采用二苯基己三烯（diphenylhexatriene，DPH）对细胞膜进行标记，经激光共聚焦显微镜进行动态观察。发现慢冻法储存的人表皮细胞复温后膜流动性明显下降，而玻璃化保存细胞的流动性只有轻微下降。说明玻璃化法能减轻冷冻对细胞膜流动性的影响，其可能的原因是玻璃化法使细胞膜中水分和脂质在结晶前就转变为玻璃态，可以有效避免因为冰晶形成所引起的细胞膜损害。

2.玻璃化对细胞骨架的影响　细胞骨架是维持细胞形态、移行、黏附等功能的重要结构，主要由微丝、微管和中间丝组成。其中微丝是细胞骨架的基本结构成分，微丝由3种蛋白质参与组成，分别是肌动蛋白、肌球蛋白和肌动蛋白结合蛋白。在细胞中肌动蛋白主要以单体（G-肌动蛋白）和多聚体（F-肌动蛋白）两种形式存在，其中F-肌动蛋白是微丝的主要组成成分，是构成细胞骨架的基本结构。笔者通过激光共聚焦显微镜对两种储存方法保存的表皮细胞进行观察，发现经过玻璃化储存的表皮细胞基本保持了正常表皮细胞F-肌动蛋白分布的特点，荧光强度无明显变化；而经过慢冻法保存的表皮细胞只保持了细胞周边的边缘致密带，而细胞内的张力丝完全消失，荧光强度大大降低。微丝和张力丝的破坏和消失对表皮细胞的功能尤其对细胞的互相黏附和细胞与基质的黏附有重大影响。

3.玻璃化对皮肤基底膜和表皮细胞黏附的影响　皮肤的基底膜是连接表皮及其下层的由细胞外基质组成的一种结缔组织基质，其中含有较多的中性黏多糖，因此在使用PAS染色时形成红色的染色带，也称为基底膜带（basement membrane zone，BMZ）。BMZ在表皮真皮的连接，对表皮细胞功能和组织结构的维持、表皮的创伤修复以及皮肤屏障功能等方面起重要的作用。BMZ中含有大量的细胞外基质蛋白，包括Ⅳ和Ⅶ型胶原、层粘连蛋白（LN）、纤连蛋白（FN）、硫酸软骨素等。这些基质蛋白是构成表皮细胞与基底膜黏附的结构基础。观察正常皮肤慢冻储存和玻璃化储存皮肤基底膜PAS染色，慢冻法储存皮肤基底膜带棕红色明显变浅，且不连续，而玻璃化法储存皮肤基底膜带染色深、宽，连续性好，与正常皮肤差别不大。而应用免疫组化法检测Ⅳ型胶原、层粘连蛋白的结果也显示玻璃化法较慢冻法储存的皮肤标本更加接近于正常皮肤；黏附性检测也表明玻璃化法能减轻冷冻对表皮与表皮下组织的黏附功能的损伤。

二、玻璃化储存皮肤的临床应用

（一）玻璃化储存皮肤应用时的注意事项

影响大张异体皮加微粒皮移植成活的因素及其防治措施与其他移植皮肤成活的因素和防治措施是一致的，主要有如下防治措施和注意事项。

1.感染　无论全身的或局部的感染，特别是创面局部感染是导致植皮失败的主要因素，鉴于此，要根据病人的具体情况，如细菌培养的结果、药物的敏感性，有针对性地给予抗生素治疗，尤其强调术中用药一次，对防治全身性感染至关重要。植皮前创面局部依次用过氧化氢溶液、外用盐水和庆大霉素或氯霉素液冲洗、湿敷创面，以减少局部的菌量，效果好。全身和局部的感染防治是保证植皮成活的重要环节。

2.全身情况不佳　营养不良、贫血、低蛋白血症、水电解质平衡失调是导致植皮失败的另一重要原因。要提高植皮成活率，必须改善病人的全身情况，加强营养支持与调理，合理应用血液制品和重组人生长激素等，重视病人全身状况的改善，是植皮成活的基础。

3.创面坏死组织未彻底清除　坏死组织的存在异体皮和微粒皮均不能成活。保证植皮成活率，术中必须将坏死组织彻底清除，以保证移植物在有生机的、血运良好的创面上成活。

4.皮片下血肿　如术中止血不充分，创面渗血多，微粒皮与异体皮不能与创基接触，也会导致皮片不能成活。对此，除了术中良好的止血外，在异体皮上开小孔引流，可防止此情况的发生。术后适当应用止血剂，对防治创面渗血也有一定帮助。

5.皮片移动、包扎压力不当　微粒皮或异体皮生长过程中，若有移动，新生的血管断裂导致皮片失活，为防止此现象发生，术中对不便包扎的部位，应留线打包包扎，关节部位应使用石膏托、可塑性夹板等予以固定。包扎压力不当亦是影响植皮成活的原因。压力过大可致皮片坏死，肢体不适，压力过小，创面易渗出，皮片易移动。因此，适当厚度的敷料，适当加压包扎，亦是提高植皮成活率的措施之一。

6.玻璃化储存异体皮质量不佳　除了上述影响微粒皮成活的因素外，最重要的当属异体皮的质量。异体皮成活率高，自体微粒皮固定在下方，此时局部环境符合生理条件，适合皮粒生长、扩展，可在异体皮坏死脱落后，创面完全愈合或基本愈合。反之，异体皮的质量差，活力低，不但不能暂时覆盖创面为大面积烧伤病人度过感染危机等提供条件，其还可能成为细菌生长、繁殖的良好培养基。对此覆盖创面的异体皮最好是新鲜尸体皮，亦即死亡后室温下不>6h，或置4℃冰箱内不>24h的异体皮。若用冷冻低温储存的异体皮，皮肤的活力应保持为储存前50%以上，方能保证移植后的植皮成活率。

（二）玻璃化储存皮肤的临床应用分析

分析将储存1周到24个月的异体皮移植到烧伤早期削痂、切痂的创面278例病人、398例次手术的效果。其中男性182例，女性96例，年龄8～78岁。烧伤总面积20%～98%（平均55.3%），Ⅲ度面积15%～72%，一次植皮面积500～4650cm2，植皮时间在烧伤后3～16d。398例次手术共应用玻璃化异体皮117cm2，总的植皮成活率达94%。其中成活率95%以上者349例次（87.7%），50%～94%者26例次（6.5%），50%以下者23例次（5.8%）（表6-2）。

皮片移植于创面后，贴附良好，皮肤术后3～4d后开始转红，除个别皮片外，94%以上的皮片均未见有出现水疱或表皮脱落现象。如在异体皮移植同时行微粒植皮或移植后再行自体皮嵌入者，在异体皮排斥以前移植的自体皮已经爬开扩大，手术部位不再出现裸露的创面而完全愈合。

又将10例烧伤和整形病人手术中剩余的自体皮肤，进行玻璃化储存。储存后3～30d再移植于病人本人的伤后10～40d的陈旧肉芽创面，成活率>50%者达60%，且能永久成活。而应用慢冻法储存的自体皮，移植于陈旧的肉芽创面成活率仅为5%。

（三）玻璃化储存皮肤和自体微粒皮覆盖创面后的转归

1.玻璃化储存异体皮和自体微粒皮移植后刨面修复过程　可分为如下两种情况。

（1）异体皮发黑、变干、脱落，创面愈合：行大张异体皮加自体微粒皮移植后皮片3～4d转红，除个别病例外，大部分皮片未见水疱出现或表皮脱落，1～2周可见异体皮色泽近似正常皮肤，此后可见有斑点状或斑片状发黑区，这些斑点状或斑片状发黑区即为成活的自体微粒皮。此后黑色斑片逐渐扩大、融合，而异体皮成片发黑、坏死，经4～6周异体皮大部分坏死成干痂，但仍附着比较牢固，此时自体微粒皮已融合成片，以后异体皮完全变干脱落，创面即被自体皮覆盖。上述异体皮成片发黑坏死，为什么有的在术后4周左右，而有的则发生在6周左右，这主要取决于自体微粒皮移植密度，以及微粒皮能否爬开，创面愈合。自体微粒皮密度高，则创面愈合早，异体皮成片发黑亦早些，反之，异体皮成片发黑晚些，说明创面愈合晚一些。如果手术过程操作精细，自体微粒皮方向性好，分布均匀，异体皮下无积血、积液，当异体皮变干逐渐脱落后，其下的微粒皮互相融合，创面可完全愈合，或仅有少许小创面残留，但经换药后即可迅速愈合。也有部分病例当异体皮变干脱落后，其下的微粒皮未完全愈合，尚有较大创面残留，需移植自体皮修复创面。

（2）未见异体皮发黑、变干、脱落，而创面愈合：异体皮成活后，自体微粒皮在其下生长、扩展，并逐渐融合成片，始终未见异体皮变黑、坏死及脱落的现象，仅有脱屑表现，直至创面完全愈合。其原因可能是异体皮逐渐地被自体皮取代，其脱落过程不明显，也有可能异体皮的表皮成分以脱屑的方式逐渐脱落，真皮成分仍然残存在自体皮下，这一问题有待进一步研究。

2.玻璃化储存异体皮和自体微粒皮移植后的结果　据统计，1997-2001年间，解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所对172例大面积深度烧伤病人采用早期切痂大张异体皮加自体微粒皮移植术，男140例，女32例，伤员年龄为1.5～72岁，平均（31.08±14.46）岁；烧伤总面积10%～100%，平均为56.2%，Ⅲ度烧伤面积为5%～99%，平均为（36.0±29.2）%，死亡13例。创面面积分别为50%～70%者19例，30%～49%者49例，20%～29%者34例，10%～19%者54例，10%以下者16例，受皮区与供皮区面积之比最小为5:1，最大为30:1，创面的愈合时间在15～30d之间。

一次植皮面积450～6560cm2，植皮部位以四肢为最多148例次，胸腹部次之31例次，背部最少21例次，大部分病人伤后3～5d手术，最早为伤后1d，最晚为伤后40d，玻璃化法储存的异体皮从储存到应用的时间为7～720d。

本组172例植皮成活情况是：成活率>90%者164例（96.4%），70%左右者6例（3.6%）；2植皮未成活，1例原因是皮片植于电烧伤截肢的残端，基底肌肉仍呈进行性坏死，导致植皮失败，另1例为全身脓毒症创面严重感染，切痂移植的自体皮也一并脱落未成活。应用玻璃化储存的异体皮总的成活率为96.8%。大张异体皮和自体微粒皮移植，皮片成活后3～4d转红，除个别病例外，大部分未见水疱出现或表皮脱落。自体微粒皮在异体皮的保护下生长、扩展，互相融合，完全覆盖创面或创面愈合>90%，仅有少许小创面残留，经换药后迅速愈合。有的病例自体微粒皮未能完全相互融合，创面愈合在70%左右，但尚有较大创面残留需要补充自体皮。如上所述，个别病例异体皮未成活，是因皮下积液、积脓或移植于坏死肌肉的残端，并非异体皮质量所致。

应用玻璃化储存的异体皮和自体微粒皮修复愈合后的创面比较平整，瘢痕较轻，这是由于微粒皮间距小，明显小于大张异体皮开洞嵌植小块自体皮或一般植皮所允许的1cm间距，因而微粒皮融合互相衔接紧密，形成的瘢痕就少。

3.玻璃化法储存皮肤和自体微粒皮移植的组织学变化

（1）术后3周，覆盖的异体皮脱落，新生的皮肤组织表皮角化不全、棘细胞层肥厚，表皮突延长，真皮浅层水肿，小血管增生，真皮下层胶原纤维增生，血管扩张，其周围可见淋巴细胞、单核细胞浸润，未见皮肤附件。

（2）术后1年，表皮角化不全和角化过度；真皮胶原纤维增生，真皮层小血管周围较多淋巴细胞浸润，未见皮肤附属器。

（3）术后3年，皮肤表皮角化不全，表皮层较薄，真皮胶原纤维增生伴透明变性，未见皮肤附属器结构。

（朱兆明　贾晓明）

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