蛙坐骨神经－腓肠肌标本的制备

实验一　蛙坐骨神经－腓肠肌标本的制备

一、实验目的

1.学习蛙类动物破坏脑和脊髓的方法。

2.学习制备蛙类坐骨神经－腓肠肌标本的方法，并掌握生理学实验的一些基本操作技术。

二、实验原理

制备蛙类的坐骨神经－腓肠肌标本是生理学实验的一项基本操作技术。蛙类的一些基本生命活动和生理功能与恒温动物相似，但其离体组织或器官在体外保持活性所需要的理化条件比较简单，易于掌握和控制。若将蛙的神经－肌肉标本放在任氏液中，其兴奋性在几个小时内可保持不变。因此，在生理学实验中常利用蛙的坐骨神经－腓肠肌标本来观察和研究神经肌肉的兴奋性、兴奋过程、刺激规律、肌肉收缩及生物电现象等。

三、实验对象

蛙类。

四、实验器材

蛙类手术器械1套（瓷盘1个、金属探针1支、蛙板1个、蛙钉4个、粗剪刀1把、组织剪1把、眼科剪1把、镊子1把、滴管1个、150mL烧杯2个、培养皿1个、锌铜弓1个、玻璃分针2根、手术线若干）、废物缸等。

五、实验药品

任氏液。

六、实验步骤和观察项目

1.破坏脑、脊髓

取蟾蜍一只，用自来水冲洗干净。用左手的中指和无名指固定蟾蜍双前肢，用无名指和小指固定双后肢，食指下压吻部，使整个躯干做最大屈曲，以充分暴露其枕骨大孔，拇指置于骶髂关节的下方。右手持金属探针沿背中线由头部向尾部划触、感觉有落空感处即为枕骨大孔所在。将探针由枕骨大孔处垂直刺入，先将探针尖端转向头端，向前进入颅腔内，然后充分搅动探针，彻底捣毁脑组织。此时能听到探针与颅骨的摩擦声。脑组织捣毁后，将探针退回枕骨大孔处并将探针尖端转向尾部，左手从侧面捏住脊柱，此时能感觉到椎管所在位置，然后单方向转动探针并逐渐刺入整个椎管内，捣毁脊髓。针进入椎管的感觉是，探针的活动度很小，而且随着进针蟾蜍出现下肢僵直，有时伴有排尿现象。脑和脊髓破坏完全的标志是：蟾蜍下颌呼吸运动消失，疼痛反射消失，四肢松软，有时伴有排尿现象。如动物仍表现四肢肌肉紧张或活动自如，应重新破坏（图2－1－1）。

图2－1－1　破坏脑和脊髓

2.剪除躯干上部及内脏

左手握蟾蜍双后肢，使其头部自然下垂，右手用粗剪刀在骶髂关节水平以上至少约1cm处横断脊柱（图2－1－2－a）。使蟾蜍头、前肢及内脏自然下垂，用粗剪刀沿腹壁两侧剪除头、前肢、内脏及相连的皮肤和组织，仅留下后肢、骶骨、脊柱以及紧贴于脊柱两侧的坐骨神经丛。剪除过程中注意勿损伤坐骨神经（图2－1－2－b）。

3.去皮

先用粗剪刀剪去肛门处的皮肤，然后用左手或镊子固定脊柱，注意勿触碰脊柱两侧的神经，右手捏住脊柱断端的皮肤边缘，逐步向下牵拉剥离皮肤（图2－1－2－c）。如果下肢撕皮困难，可在撕皮至股部时，用手钩住双股中间后再行撕剥。将全部皮肤剥除后，将标本置于盛有新鲜任氏液的培养皿中。

4.清洗双手及器械

将双手及用过的剪刀、镊子、蛙板等全部手术器械用自来水洗净，防止蟾蜍皮肤的分泌物影响神经肌肉组织的活性。

图2－1－2　剪除蛙躯干上部及内脏

a.横断脊柱　b.剪去头、前肢及内脏　c.剥皮

5.分离双后肢

用镊子取出标本，左手捏住脊柱断端，使标本背面朝上，右手用粗剪刀剪去突出的骶骨（也可不进行此步）。然后将脊柱腹侧向上，左手的两个手指捏住脊柱断端（注意勿触及神经），用粗剪刀沿脊柱正中线将脊柱分为两半，再从耻骨联合中央剪开（注意行此步时应避免剪刀走“S”形，以保证坐骨神经的完整），将分离好的两个单后肢浸入任氏液中备用。

6.完成坐骨神经－腓肠肌标本

（1）游离坐骨神经 取一侧后肢，有坐骨神经和腓肠肌的一面向上，用蛙钉固定在蛙板上，固定的松紧要适度。先用玻璃分针沿脊柱侧游离坐骨神经腹腔部（坐骨神经呈亮白色束状），然后顺股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟纵向暴露并分离坐骨神经的大腿部分直至膝关节，在近脊柱处穿线结扎坐骨神经，并在结扎点的上方从脊柱根部将坐骨神经剪断（可保留一小块脊椎骨）。在分离过程中，把神经周围的结缔组织去除干净，并把坐骨神经的细小分支剪断，但注意不要用金属器械触碰神经，也不要对神经过度牵拉，且应不断滴加任氏液使神经保持湿润。

（2）游离股骨 将游离的坐骨神经搭在腓肠肌上，用组织剪从膝关节周围向上剪除大腿部的所有肌肉，并把膝关节上方的股骨刮干净，在距膝关节上1～1.5cm处用粗剪刀剪断股骨。

（3）游离腓肠肌并完成标本 用玻璃分针分离腓肠肌并在跟腱处穿线结扎，在结扎点的下方用剪刀剪断跟腱，左手持线提起坐骨神经及腓肠肌，然后用粗剪刀从膝关节处剪去小腿除腓肠肌的其他部分，注意勿损伤支配该肌的神经分支。现在所得到的就是带有一小段股骨的坐骨神经－腓肠肌标本。将标本浸入盛有新鲜任氏液的培养皿中待用。

标本各部连接关系如下：

线→坐骨神经→膝关节（股骨小段）→腓肠肌→跟腱→线（图2－1－3）

图2－1－3　坐骨神经－腓肠肌标本

7.检查标本的兴奋性

取锌铜弓并在任氏液中沾湿两极后，将坐骨神经同时与两极接触，如腓肠肌发生一次迅速而明显的收缩，表明标本具有正常的生理活性，兴奋性良好，可以用于实验。

七、注意事项

1.制备神经肌肉标本过程中，要不断给标本滴加任氏液，防止标本干燥，以免影响标本的正常生理活性。

2.毁髓过程中应注意使蟾蜍头部向外侧（不要挤压耳后腺），防止耳后腺分泌物射入实验者眼内（如被射入，则须立即用生理盐水冲洗眼睛）。

3.操作过程中应避免过度牵拉或用手及器械损伤神经或肌肉。

4.剥皮后必须清洗双手及用过的器械，避免蟾蜍体表分泌液和血液污染标本，但是不能用自来水冲洗标本，以免影响标本活性。

5.锌铜弓检查标本活性时，必须两极同时与神经接触。

6.标本制成后须在任氏液中浸泡数分钟，待标本兴奋性稳定后，再开始实验，效果较好。

八、思考题

1.捣毁脑、脊髓后的蟾蜍有何表现？若破坏脊髓不彻底，蟾蜍会有什么表现，为什么？

2.锌铜弓为什么能用来检查标本的兴奋性？若无锌铜弓，能否用其他方法来检查标本的兴奋性？

3.通过制备坐骨神经－腓肠肌标本，你对生理学实验有何感想？