鼠疫血清学诊断

第二章　鼠疫血清学诊断

O-抗原结构示意图

鼠疫血清学诊断，作为鼠疫的辅助诊断技术，在鼠疫自然疫源地调查、监测及鼠疫病人的诊断和追溯诊断方面，具有重要的参考和实际应用价值，由于目前我们的鼠疫血清学诊断技术都是以F₁抗原或抗体进行的，非特异性凝集时有发生，给我们带来了许多麻烦，为此我们应开发鼠疫特异性的联合抗原诊断方法，如：利用F₁抗原、V抗原、Pla蛋白酶活性物质及鼠毒素等抗原成分的血清学诊断方法，使鼠疫血清学诊断更具有特异性和科学性。

脂多糖（LPS）为内毒素，由特异性多糖、核心多糖和脂质A组成。只有细菌死亡裂解后，LPS才游离起毒素作用，属膜表面作用毒素。但鼠疫菌脂多糖基因编码区域存在5个假基因，只能合成粗糙的脂多糖。同时O－特异性多糖链也不能延伸，无法形成细菌的O抗原决定簇。从而造成我们无法利用O抗原对鼠疫菌进行血清学分型。这种突变更利于Pla基因生物酶活性的发挥。

当然我们采用的IHA和RIHA都是鼠疫经典性的F₁血清学方法。包括青海地方病防治研究所20世纪80年代开发的酶联免疫吸附试验（ELISA）和新疆地方病防治研究所90年代研制的鼠疫单克隆抗体检测技术、国外采用的免疫荧光检测技术和胶体金免疫层析法及渗透法技术等都是实用性很强的鼠疫血清学诊断方法，但都是围绕F₁抗原或抗体进行的，对那些自然界的鼠疫突变株（如缺失或发生了F₁基因的突变株），可能就显得无能为力，再加上目前对鼠疫菌在自然界保存机理研究不清，特别对那些处于“静息期”状况的疫源地调查。就必须采取鼠疫多抗原联合血清学诊断方法，使鼠疫血清学诊断更具特异性、灵敏性和科学性。

影响间接血凝的因素主要有：①配置溶液的离子浓度及酸碱度；②醛化血球的制作工序（单宁酸、醛化处理过程等）；③F₁抗原的提取及纯化技术；④被检样品中含有异种凝集素或外源性凝集素所引起的非特异凝集反应；⑤由病原微生物之间交叉抗原或抗体所引起的非特异凝集反应；⑥被检血清的实验室交叉污染。

为避免人为因素导致间接血凝试验中非特异性凝集的发生，近年来广东动物鼠疫监测中鼠类血清的采集，使用股动脉放血。采血前统一用95%的酒精消毒，排除了来苏消毒液对鼠疫F₁间接血凝试验的影响。所用的微量板、吸嘴、吸管首先在1%的盐酸溶液中浸泡12h，然后用自来水彻底清洗干净，再用蒸馏水冲洗两次，甩去水分，置48℃温箱12h烤干（孔口向下）备用。尽可能排除人为因素如：洗涤液和污染对鼠疫F₁间接血凝试验的直接影响。同时现场对初筛检出阳性的血清样，在没有对原全血样灭活的前提条件下，进行全血样的细菌培养和分离，结果细菌培养阴性，排除了可能由病原微生物污染血样所引起的非特异性凝集反应。同时通过鼠类血清的灭活过程，去除了由补体借导的非特异抗原、抗体的凝集反应。当然不排除被检血清中含有血红素凝集成分的存在，直接引起鼠疫F₁致敏血球间的凝集反应。特别是在动物进食了新鲜豆科植物根茎叶及果实的情况后，经消化道吸收可引起血红素凝集素（唣类等）成分。以及马鼻疽、类鼻疽假单胞菌抗原的交叉性等。

鼠疫血清的放射免疫沉淀试验的特异性远远高于间接血凝试验。将鼠疫F₁间接血凝试验检出的127份假阳性血清，再进行鼠疫血清的F₁放射免疫沉淀试验，结果全部为阴性。说明鼠疫血清F₁放射免疫沉淀试验的特异性高于F₁间接血凝试验。

我们现在所采用的鼠疫间接血凝试验，是将所谓提纯的鼠疫菌F₁抗原致敏于单宁酸处理的绵羊红血球上，以检测鼠疫菌针对的特异性抗体的血清学方法。当特制的这种血球表面抗原在一定的介质中与相应的鼠疫的抗体相遇时，这种特有的抗原和抗体就会发生免疫化学反应（由于水溶性的F₁抗原与抗体结合发生反应肉眼不可见）。水溶性的抗原和抗体发生的凝集反应可通过一种载体（红血球）扩大凝集反应的颗粒，来表现出来。那么F₁抗原的提取纯度将直接影响间接血凝试验的特异性和敏感性。我们现在F₁抗原的提取工艺还是沿用WHO 20世纪50年代的方法，这种方法提取的F₁抗原成分是一种复合性的糖蛋白，分子量20000～50000之间；至少由4种亚单位（F₁A、F₁B、F₁Aa、F₁Bb）组成，分子量15000～17000之间。最新的研究表明，F₁抗原由13种蛋白构成。由于提取不纯，可能会直接影响到鼠疫血清学的诊断结果，即鼠疫F₁间接血凝的特异性受到质疑。为此我们必须在提取工艺上进行革新，把目前我们提取所谓纯的F₁抗原再通过透析、电泳（CE）及亲和层析技术，分离提取真正纯的“F₁”抗原成分，用于鼠疫血清学诊断。提高鼠疫血清学诊断的特异、敏感和科学准确性，避免与其他病原微生物抗原的交叉反应，阻止非特异凝集反应的发生。当然近年来随着单克隆技术的发展，鼠疫酶联免疫吸附（ELISA）和免疫胶体金技术（特别是DIGFA）得以应用，其特异及灵敏性都很高。尤其是在快速诊断方面，显示出方便和快捷的特点。

当然在鼠疫血清学诊断方面，由于我们现在所有的方法都是围绕F₁进行的，面对自然界中鼠疫菌F₁基因发生突变的非典型菌株，就显得无能为力。新疆曾从一只灰旱獭体内分离出一株F₁基因发生突变的野生株，用WHO推荐的鼠疫诊断“金标准”——四步检验法，全部为阴性；在动物实验方面，接种小白鼠后弱毒力，但该菌株在小白鼠体内连传4～6代后，反向血凝试验和四步检验开始转向阳性，对我们现行的诊断方法提出了挑战。再加上我们的鼠疫菌分离培养技术都是沿用上世纪50年代的方法，很少能从健康的活鼠体内直接分离到鼠疫菌，大部分菌株分离是在动物间发生鼠疫暴发流行时或出现自毙鼠时获取的。为此我们必须加强鼠疫病原学和血清学的研究，在病原学方面，以PCR技术和生物芯片技术为导向，才能大大提高鼠疫菌在自然界的检出率。在血清学方面，要开展鼠疫菌多种特异性抗原标记方法的研究，克服F₁抗原技术检测的局限性。

在广东不同地区来源的鼠类血清样本中，鼠疫F₁间接血凝出现假的阳性率明显不同，非疫区明显高于疫区。在自然界是否细菌也与别的高等生物一样，同一物种不能同时存在于同一地区，以及耶尔森菌属的进化有关，值得进一步探讨。