技术的基本原理和方法

第一节　PCR技术的基本原理和方法

从分子生物学的萌芽阶段起，就一直追求获得大量单一纯的DNA分子，这是认识这种高分子化合物、研究其结构和功能的前提。早期，基因克隆是获得这种分子的唯一方法。基因克隆的基础，是DNA复制过程。我们所需要的DNA节段，被连接在一种载体上，引入到大肠杆菌这样的细胞中，经过复制，就获得了大量的与当初克隆进去的节段同样的DNA分子。

人们也希望在更简化的条件下，也就是在试管内来实现这一过程。随着一种耐高温的DNA多聚酶，即Taq DNA多聚酶的发现，这种愿望终于成为现实。随之出现了一种新技术，叫作聚合酶链式反应，依其英文字头简称为PCR。这种技术一出现，就显示了巨大的应用前景，在不到20年的时间里，几乎在分子生物学和核酸工程的每一个领域中都得到了广泛的应用，并使许多以往不可能做到的事情成为可能。如研究基因克隆、DNA测序、分析突变，细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建与表达，法医犯罪现场标本分析，各种肿瘤检测等。可以毫不夸张地说，PCR技术已经表明是近年来核酸工程中最重要的技术突破。

如果PCR产生的是一种病原微生物特有的DNA片段，自然可以用来侦检这种微生物的存在。由于它可以将极其微量的目标DNA片段扩增到非常大的数量，而且不受同时存在的大量其他核酸分子的干扰，PCR技术就成了当前最敏感的侦检手段。

为理解PCR过程，我们在这里复习一下生物细胞内的核酸复制过程。在生物细胞的染色体复制阶段，染色体DNA的双链结构在酶的作用下解旋，解离为两条单链。在引物酶的作用下，在单链DNA的一些部位，合成了与其相对应的短链RNA分子，这就是引物。然后，DNA多聚酶结合在模板与引物结合而成的双链结构上，开始合成过程，将与模板互补的三磷酸单核苷酸逐一连接在引物的3′末端上。这个合成过程又称为链延伸过程，直到DNA链遇到下一个引物。

一、PCR的原理

DNA聚合酶链式反应（PCR）

DNA多聚酶将其前面的RNA引物逐步降解，并以DNA取代之。最后，连接酶将这样合成的DNA节段连接起来，成为和解旋离去的那条DNA单链完全一样的一条新的DNA链，结合于其模板链之上。于是，一条双链DNA构成的染色体就成了完全一样的两条，为细胞分裂做好了准备。

聚合酶链反应（PCR）是由Mullis等人（1985）建立起来的一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，即无细胞分子克隆技术，是基因分析技术的一项重大突破。国外Hinnebusch（1993）、Campbell（1993）、Norkina（1994）、Hiroko（1996）等人先后将PCR技术应用于鼠疫菌检测，我国张景林（1994）等也建立了鼠疫菌PCR检测方法并初步应用于鼠疫菌的检测和鉴定等方面研究。实验证明，PCR技术在鼠疫监测、分子流行病学研究、基础研究、快速诊断等方面具有良好的实用性与应用前景。国内已开展了F₁－PCR扩增和Pla－PCR扩增检测，云南省于1998年建立了Pla－F₁－PCR鼠疫双重式聚合酶链反应，可弥补常规病原学在检出非典型菌株和常规血清学不能检出那些F₁抗原含量低的菌株和F₁基因不表达菌株。云南省首先在国内建立了双重式PCR检测鼠疫菌、鼠类脏器、感染蚤及疑似鼠疫病患者淋巴液等材料。目前国外所采取的送检样本预处理—密度梯度离心（即悬浮）法，也是一种很好PCR样本预处理的DNA纯化技术。

当然随着DNA芯片技术进一步的开发和利用，使鼠疫菌的诊断水平上升到基因组水平，最终取代PCR技术。将人工合成的鼠疫菌特异性寡核苷酸探针点布并固定在只有几个平方厘米大小的硅片、玻片或尼龙膜等固相载体上，利用高密度寡核苷酸微阵列杂交技术获知鼠疫菌特异性基因片段。

PCR是一种模拟自然DNA复制的体外扩增法。通过试验反应使极少的基因组DNA（或RNA）样品中的特定基因片段，在短短几小时内扩增上百万倍。这一反应要求如下条件：①要有单链模板DNA与寡核苷酸引物形成的模板及引物复合物；②dNTPs为酶反应底物（合成DNA新链的原料）；③适当pH的缓冲液，尤其是其中Mg²⁺浓度十分重要；④DNA耐热性聚合酶。

扩增DNA片段的长度及特异性是由2个寡核苷酸引物的序列决定的，即后者分别与待扩增DNA片段两条链的两端序列分别互补。PCR就是反复进行热变性—复性—引物延伸3个步骤的循环过程。这一过程于热循环仪（即基因扩增仪）中自动实现。

1．热变性　模板（样本）基因组DNA在95℃～97℃下加热1～5min，双螺旋结构解链成单链。

2．复性　将反应混合物降温，使引物与单链DNA模板（或从mRNA逆转录而来的DNA）上互补的序列复性，即退火，形成模板—引物复合物。复性温度决定于引物的Tm值。（Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳）。

3．引物延伸　迅速加入耐热性DNA聚合酶（2单位），混匀。在DNA聚合酶作用下，以dNTPs为原料，从引物的3′端开始，沿着5′→3′的方向，按照模板链上的序列，合成一条新的DNA链。其序列与模板序列互补，延伸时间决定于扩增片段的长度。新链合成速度非常快，每秒可延伸40～60个碱基。反应时，将待扩增的DNA模板加热变性，然后降低反应混合液温度，使引物与模板DNA互补退火，此时两引物的3′端相对，5′端相背；将反应混合液温度升至中温，在Taq DNA多聚酶的作用下，以dNTP为原料，以引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸成为两条双链。如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段，这三次改变温度为一个循环。由于第一次循环扩增的产物又充当下一次循环的模板，所以在这一周而复始的过程中，每完成一次循环，就基本上使目的DNA产物增加一倍。理论上讲，扩增DNA产量是指数上升的，即n个循环后，产量为2ⁿ拷贝。这一指数反应的主要产物是一段双链DNA，它的两个末端由寡核苷酸引物的5′端来决定，而长度则取决于两引物间的距离。此外，反应过程当中也会产生较两引物限定区长的DNA产物，它仅能发生在以原始模板DNA为模板的扩增产物中，这种长产物仅以线性速率增加。而限定长度的DNA分子在扩增中以指数方式积聚，构成反应的主要产物。后按扩增的DNA片段长度基本上都限定在两引物5′端以内，在凝胶电泳上显示为一条特定长度的DNA区带。

鼠疫检测PCR技术是以鼠疫菌的胞浆素原活化因子（Pla）基因和F₁抗原基作为目的基因，通过体外扩增技术而建立起来的目前最先进的鼠疫病原学检测方法。该方法具有快速、简便、特异性强、敏感性高等优点，对待测样品纯度要求不高，经氯仿熏杀或煮沸后可于普通实验室内进行，并在4～5h内得到准确的结果。

许多研究资料证明，常规的病原学四步诊断很容易检出典型的鼠疫菌，却很难检出非典型状态的鼠疫菌；常规的血清学方法能检出F₁基因表达的鼠疫菌感染机体，却不能发现对于F₁基因不表达的鼠疫菌感染机体。鼠疫PCR方法则弥补了这两种常规方法的缺陷。

二、被检材料（扩增模板）的制备

不同来源的材料标本其模板DNA制备方法有些差别。由于PCR扩增技术对标本DNA的质量和数量要求较低，因此常规的DNA制备方法都能满足PCR扩增要求。下面介绍加热煮沸法。

1．细菌培养的标本　取少量被检菌培养物（强毒菌先经氯仿熏杀），混悬于盛有100μl灭菌双蒸水的1．5ml微量离心管中，煮沸8～10min，离心（4000r／min，5min），取上清l～5μl作为模板。

2．动物脏器标本　取被检动物肝、脾组织100mg，加双蒸水400μl于玻璃匀浆器中研磨，将制得的悬液移至微量离心管中，煮沸8～10min，离心（4000r／min，5min），取上清1～5μl作为模板。

3．蚤类标本　单匹蚤用100μl双蒸水，分组蚤（5匹／组）用500μl双蒸水置匀浆器中研磨，将悬液移至微量离心管中，煮沸8～10min，离心（4000r／min，5min），取上清1～5μl作为模板。

4．痰样本　痰液标本的处理方法有一定的特殊性。一般应采清晨第一次咳出的痰液，带有血丝的痰液阳性率相应较高，采样时应收集带血丝部分或有干酪颗粒的部分。由于痰液较黏稠，因此能否较彻底地清除黏蛋白是标本处理的关键。我们最常用的方法是用1N的NaOH充分液化样本，离心分离细菌，也可以用胰蛋白酶K液化痰样本。相比之下，NaOH简便、快捷，最为常用。当痰液很浓稠时，常规的NaOH的量则应提高液化温度（37℃）水浴20min。

对于组织来源标本，由于取样量过多造成杂质含量增高，对PCR结果产生一定影响。这时可采用以下方法处理模板。取50μl组织悬液，加550μlSET（含100mmol／L Tris·Cl，pH7．8，10mmol／L EDTA，200mmol／L NaCl），加蛋白酶K使终浓度为400μg／ml，加SDS使终浓度为1%，37℃过夜消化，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）混合物抽提，异丙醇沉淀，然后用双蒸水溶解沉淀物，即为模板样品。

三、试剂

1．引物　根据鼠疫菌的Pla基因或F₁基因序列由基因合成仪合成19～25个碱基长的相应DNA引物对，其浓度为0．2μg／μl。所谓引物就是与待扩增DNA片段两侧互补的寡核苷酸。

2．dNTPs　即寡核苷酸dATP、dGFP、dCTP、dTFP的混合物，配成2．5mmol／L（pH8．3）。

3．10×缓冲反应液　含50mmol／L KCl₂，10mmol／L Tris·Cl（pH8．3），1．5mmol／L MgCl₂。

4．耐热性DNA聚合酶　即Taq DNA聚合酶

以上试剂应小量分装，保存于－20℃。

5．5×TBE（电泳缓冲液）　含54gTris（三羟甲基氨基甲烷），27．5g硼酸，20ml 0．5mol／L ED－TA（二胺四乙酸二钠），加双蒸水至1000ml。使用时稀释至0．5×（即10倍）。

6．溴化乙啶（EB贮存液，200μg／ml）：取1mg溴化乙啶溶于5ml双蒸水中，充分搅拌溶解，将容器包被铝箔或转移至棕色瓶中。使用时稀释成0．5μg／ml。

7.1mol／L Tris　将121．1gTris溶于800ml双蒸水中，加浓HCl调节pH至8．0，定容至1000ml，分装，高压灭菌。

8．0．5mol／L EDTA　称取186．1g EDTA-Na₂·2H₂O溶于800ml双蒸水中，充分搅拌溶解，用NaOH调pH至8．0，定容后分装，高压灭菌。

9．10%SDS（十二烷基磺酸钠）　将100g电泳级SDS溶于900ml双蒸水中，加热至68℃促进溶解，加数滴浓HCl调pH至7．2，定容后分装。

10．0．25%溴酚蓝（加样缓冲液）　将0．25g溴酚蓝，40g蔗糖，溶于100ml双蒸水中，分装。以上试剂可贮存于室温或4℃保存。

四、方法

1．PCR反应体系　在0．5ml微量离心管中，依次加入以下各试剂。一般以50μl为一PCR反应体系。

①10×缓冲液：5μl

②dNTP混合物：4μl

③Pla引物或F₁引物对：各1μl

④模板：1μl

⑤双蒸水补足至50μl。

上述各成分混匀后于水中煮沸10min，再加入耐热性DNA聚合酶2～3个单位，置基因扩增仪依次循环；94℃1min，48℃或52℃1min，72℃1min，30个循环，最后于72℃延伸7min。或其他适宜的扩增条件。

2．PCR产物分析　取5～8μl PCR扩增产物，经1%～1．5%琼脂糖凝胶电泳（4V／cm）45min，溴化乙啶染色，紫外灯下观察结果且照相。用PCR标准分子量作分子量标准。

五、注意事项

由于PCR反应极为灵敏，需要特别注意防止可能作为模板的微量DNA污染，特别是在模板DNA浓度很低的情况下进行PCR实验时，应遵循以下操作规程。

1．如可能，PCR的加样和操作应在带紫外灯的平流超净台内进行，不操作时即将紫外灯开启。将微型离心机，一次性手套，备品和移液器均放在超净台内。因为移液器管是通常的污染来源，应使用带一次性吸头和吸头推顶器的正排出移液器。所有的缓冲液，吸头和离心管在使用前均须高压。

2．在开始工作时戴上一副新的手套，经常更换手套。

3．试剂专用，并以小份储存，最好放在冷冻箱专门的格子中。配制溶液时，应使用没有接触过本实验室使用的DNA的新玻璃、塑料器皿和吸头。溶液使用过后即丢弃，不要再放回储存。

4．打开装有反应物的离心管之前，先在离心机上短暂离心10s，使液体沉积至管底，减少污染手套和移液器的可能性。

5．最好先将其他试剂加入离心管，最后加入模板DNA。加入模板后，盖上管盖，以戴着手套的手指轻轻叩击管壁混匀反应物，短暂离心以分离水相与油相。

6．在加模板DNA时，注意不要产生气泡，以免污染其他反应物。暂时不用的管子要将盖子盖紧，处理装有模板DNA的管子后更换手套。

7．只要有可能，实验应包括一个阳性对照。作为阳性对照的模板DNA应事先在实验室的另一个地方稀释。避免浓的目标DNA落在进行PCR实验的装备附近。

8．实验必须包括一个加入PCR的其他成分但没有模板DNA的阴性对照。这一对照管应在所有PCR反应管均装完之后再加入。

六、PCR各基本成分

在PCR反应中，除保证反应条件的缓冲液外，有4种基本成分参加反应。它们是：

1．引物　引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则。

（1）引物长度：15～30bp，常用为20bp左右。

（2）引物扩增跨度：以200～500bp为宜，特定条件下可扩增至10kb的片段。

（3）引物碱基：G＋C含量以40%～60%为宜，G＋C太少扩增效果不佳，G＋C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

（4）避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3＇端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

（5）引物3＇端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

（6）引物中有合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

（7）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。每条引物的浓度为0．1μmol／L～1μmol／L或10pmol／L～100pmol／L，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

引物的作用是结合在模板之上，为DNA多聚酶提供一个附着的部位，从而开始DNA合成反应。因而，PCR产物即为引物在模板上结合的部位之间的一段序列。对引物的要求是：它应当只结合在我们所希望的部位；并且有合适的量。在PCR反应中，通常使用引物的浓度为0．1μmol／L～1μmol／L。

引物合成之后，通常用紫外分光光度计来测定其含量。因而，提供引物的实验室或厂商，常以μg／ml为单位给出引物的浓度，或仅提供紫外吸收值。我们可以根据以下公式，计算引物的浓度。

引物浓度（μg／ml）＝OD₂₆₀×稀释倍数×33

其中33为单链DNA所用的数值，本公式也可用于双链DNA，那时乘以50。在PCR反应中，通常以微克分子来计算引物的浓度，最常使用的浓度为0．2μmol／L，而引物溶液的浓度通常配制成4μmol／L，因此，还需要进行浓度单位的换算。我们可以使用单核苷酸的平均分子量325，如果引物长20核苷酸，那么：

4μ mol／L＝325×20×4／1000＝26μg／ml

根据原液与储备液浓度间的比例关系，可以很容易计算出稀释倍数。储备液配制好后，可储存在－20℃。

2．模板　模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其他细胞组分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。我们已经了解，DNA的合成是依照已存在的单链DNA序列，即模板进行的。PCR用于检出鼠疫菌特征序列时，模板就由待检的样品提供，在其他情况下，都需要在反应混合物中加入需要扩增的DNA序列。PCR对模板浓度的要求并不严格。如果目标DNA是非常大的分子，首先以限制酶将其消化成适当长度的片段，对扩增更为有利。此外，环状DNA分子的扩增劣于线状分子，在扩增质粒基因时先使质粒开环更为有效。如果设置一系列已知浓度的DNA作为对照，利用PCR也可以间接地定量测定微量的目标DNA。

3．底物　合成DNA的原料为4种三磷酸单核苷酸，即通常所说的dNTPs。4种三磷酸单核苷酸为单独提供的商品。在使用前，将其配制成每种浓度各为2．5mmol／L的混合溶液，可保存在－20℃。

4．DNA多聚酶　DNA的合成需要DNA多聚酶催化。由于在PCR反应中以加热的方式使DNA解旋，其使用的DNA多聚酶必须耐热。目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。这两种酶是等效的。为了PCR的各种需要，Taq酶已衍生出许多高性能的制剂。如一般的Taq酶扩增的片段不能超过10kb，而特殊设计的Taq＋2，则可以扩增出长达30kb的片段。还有消除了外切活性的基因工程酶，可以满足一些特殊需要。在反应中通常使用的酶量为2单位，酶量过多会导致产生非特异产物，浓度过低则合成产物量减少。在非成批进行反应时，通常在所有其他反应物混合完毕后，加入0．5μl酶制剂。如成批进行反应，则可事先用1×缓冲液稀释酶，然后分装至各管中。

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1mol NaOH或1mol／L Tris·Cl的缓冲液将其pH调节到7．0～7．5，小量分装，－20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50μmol／L～200μmol／L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其他几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg^2＋结合，使游离的Mg^2＋浓度降低。

5．典型的PCR反应　按照以上各项的要求，一次总量100 μl的反应混合物如下：

蒸馏水71μl，10×缓冲液10μl，dNTPs（每种2．5mol／L）8μl，引物1（4μmol／L）5μl，引物2（4μmol／L）5μl，Taq多聚酶0．5μl，混合，模板或待测样品1μl。

上述反应物全部混合完毕后，在其表面覆盖50～100μl轻矿物油，以防止水分蒸发。

PCR扩增仪的热循环参数设置如下：

　　　　　　　变性（95℃）　　回火（40℃）　延伸（72℃）

首次循环　　　　5min　　　　　　1min　　　　3min

后继循环　　　　1min　　　　　　1min　　　　3min

末次循环　　　　1min　　　　　　1min　　　　10min

在这里，除首次变性和末次延伸设定较长时间，使反应完全外，其余循环中，变性和回火1min均足够。延伸温度由需要扩增的片段长度来决定，一般按每分钟1kb计算。但实际上，链延伸的速度每分钟常可达到1．5kb以上。如需要扩增的片段小于150bp，则无需设定扩增时间，在回火温度下，这一合成过程已经完成了。

七、PCR条件

目前，PCR技术已成为分子生物学中最简单，最可靠，也是应用最广泛的技术。如果不出错误，按照上面给出的条件，一定能够得到实验结果。然而，要准确地使用PCR技术来达到某一预定的目的，却并不是一件容易的事情。特别是在研究未知的基因时，需要花费相当的时间和试剂，确定反应的最佳条件。有时，这将决定工作的成败。

1．镁离子浓度　PCR反应需要一定的离子环境，这种环境是由缓冲液提供的。用于PCR的缓冲液通常以10×的浓度提供，其配方为：KCl 500mmol，Tris·Cl（室温pH 8．3）100mmol，MgCl₂ 15mmol，明胶0．1%。

通常商品化提供的缓冲液配方，PCR环境的镁离子浓度为1．5mmol／L。然而，有的时候我们对反应的灵敏度或特异性并不满意，可通过调节镁离子浓度来改善。一般说来，降低镁离子浓度能改善特异性，而在一定范围内，升高镁离子浓度可增加灵敏度。

对于提高反应的特异性，回火温度是首要的影响因素，但由于扩增仪通常一次只能使用一种回火温度，故实际上总是首先调整镁离子浓度，从0．5mmol／L～5．0mmol／L，选择效果最佳的浓度。

为什么镁离子浓度会对特异性产生如此明显的影响并不容易解释，DNA双链之间通过氢键，而不是离子键维系在一起。可能的解释是，如果引物与模板之间的结合并不完全合适，如在一些非特异结合部位，存在少数误配时，引物也有一定的机会结合于模板之上，从而实现一次合成过程。Taq多聚酶在回火温度下，也有一定的合成能力。镁离子能促进酶的活性。因而，当镁离子浓度高时，引物在低温度下也能迅速延伸，增加了与模板结合的稳定性。当温度升高到延伸温度时，引物的结合已经相当稳定，不容易脱落，从而产生了与引物完全适合的模板，扩增出非特异性的产物来。相反，在镁离子浓度较低时，Taq多聚酶的活性低下，引物在低温度下不会延伸。这样，当温度升高到延伸温度时，即使引物与模板完全吻合，也可能有较多脱落，这样，本来应能顺利扩增的片段，也可能难以成功扩增。因此，当需要扩增新的基因时，常需要首先确定最适的镁离子浓度。

2．变性温度与时间　变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃1min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

3．回火温度　回火温度由引物的长度和GC含量，以及引物与模板配合的完善程度决定。一般说来，如果常用的回火温度能够满意地实现扩增，并不需要进行调整。只是当特异性不满意时，才需要确定回火温度的上限。由于我们根据已发表的序列设计引物，而实际需要扩增的模板，往往来自不同菌株，可能在该序列中存在变异。同样长度，GC比类似的引物，回火温度的上限可能有相当大的差别。因此在实际操作中，回火温度常需根据实际的实验结果来确定。通常首先用较低的回火温度，然后逐步升高，直到特异性满意。当实际需要引物序列与模板序列有差异时，如需要加入限制酶位点，更需要这样做。在一些情况下，需要使用长12～15核苷酸的引物，这时可增加一段50℃～60℃的温育时间，或使温度由40℃逐步升高至72℃，以保证引物在较低温度下有一定程度的延伸。这样，当升高到延伸温度时，引物实际上已经变长，结合已比较稳定，就可以实现短引物的扩增。

引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值（解链温度）＝4（G＋C）＋2（A＋T）

复性温度＝Tm值－（5℃～10℃）

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合。

4.延伸温度与时间　Taq DNA聚合酶的生物学活性：

　　　　　　　　　70℃～80℃150核苷酸／S／酶分子

　　　　　　　　　70℃60核苷酸／S／酶分子

　　　　　　　　　55℃24核苷酸／S／酶分子

　　　　　　　　　高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70℃～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

5．循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

八、PCR反应特点

1．特异性强　PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

2．灵敏度高　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg＝10^－12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg＝10^－6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

3．简便、快速　PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性—退火—延伸反应，一般在2～4h完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染，易推广。

4．对标本的纯度要求低　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗漱液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。

5．PCR扩增产物的分析　PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

（1）凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙啶染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小，这是起码条件。

琼脂糖凝胶电泳：通常应用1%～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：6%～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

（2）酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。

（3）分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。

（4）Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。

（5）斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼龙薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

（6）核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

PCR扩增示意图

九、利用PCR检出鼠疫菌特异性序列

1．选择目的基因　希望利用PCR来检测标本中是否存在鼠疫菌时，自然必须选择鼠疫菌特异的基因，而且，必须已掌握该基因至少部分的序列，才可能据以设计引物，使PCR得以实现。

在目前阶段，符合这一标准的鼠疫菌基因有：编码F₁抗原的caf操纵子中的4个基因，鼠毒素基因，位于最小质粒上的Pla基因，以及与色素沉着有关的hms基因。实验表明，在许多已知的微生物中，并不存在这些基因的序列。在我国，已使用过扩增caf1和Pla基因的引物，表明特异性良好。

应当注意，PCR技术仍然是一项新兴的技术，已经做过的观察毕竟有限。从进化的角度，这些基因必有其来源。因此，不能认为不表达F₁抗原的微生物就一定没有与caf类似的序列。在我们实际应用这项技术时，必须记得这一点。当遇到似是而非的情况时，首先应检查是否存在类似的序列。

2．设计引物　在PCR技术中，引物设计是成功的关键。反应根据引物在模板链上结合的位置，扩增出两个引物之间的DNA片段。一般使用的引物设计没有统一标准，根据实践经验以下几个原则可供参考。

（1）引物至少长16个核苷酸，通常以20～24核苷酸为宜。尽可能地选取各种碱基随机排列，G＋C比接近50%的区段作为引物，避免选择多聚嘧啶，多聚嘌呤，能够形成发夹结构，或常出现重复的DNA区段。

（2）两个引物之间应避免互补，特别是避免其3'端重叠，以免形成二聚体。

（3）如果仅以检出为目的，两个引物之间的距离不必过长，百余碱基即可，这样可以节约扩增时间。如需要获得更长的DNA片段，则必须考虑聚合酶的能力，选择适当的酶。但目前使用的酶，很难扩增30kb以上的片段。

MM：标准分子量；1.H₂O对照；2.大肠杆菌；3.假结核杆菌（1~5型）；4.EV76；5~6.全国11块疫源地生态型鼠疫菌株785DNA；7.云南6份菌株；8.贵州6份菌株；9.广西5份菌株。

（4）引物和模板之间允许存在个别不配对碱基，这些碱基应分布在引物的5′侧。这种性质，可以用来改造产物片段的末端，以利于将来的克隆与表达。在实际设计时，首先应当将整个序列大略地看一下，选择那些碱基排列变化较大的区域，划出拟作为引物的区域。计算G＋C比例，如不合适，向左右略微移动，或稍增减引物的碱基数，以发现最合适的区域。注意，另一侧的引物应在其互补链上，因而应当以相反的顺序标出与序列资料互补的碱基。如果仅以检出为目的，将扩增的片段设计在编码序列中靠近氨基端的一侧，较容易成功。如有可能，所得的引物序列应在计算机上加以核查。现已有专用软件来进行这一工作。在已有的序列资料中，应尽可能保证引物序列只结合在目的位置上。如果存在多处与该引物相同的序列，则需要移动引物的位置。即使经过核查，引物的特异性也需要通过试验证实。这是因为，目前所积累的序列资料毕竟有限，不能保证目前未知的序列中，不存在与该引物同源的序列。经过对鼠疫菌已知菌株的扩增，只产生与设计长度相同的单一条带，而已知的其他种的细菌都不能产生扩增产物，该引物的设计才算完成，可投入实际使用。如果扩增的产物中存在其他条带，或与其他细菌也能产生反应，该引物需要重新设计。在许多情况下，将引物序列移动数个核苷酸，就可能解决问题。

3．模板的制备与处理　在鼠疫监测中应用PCR技术，通常有两种情况。可以是首先分离出细菌，利用PCR技术来确定其是否为鼠疫菌。这时，运用上面介绍的提取质粒或染色体DNA的方法来制备模板DNA，再行扩增当无问题。人们更希望利用PCR直接从自然界的标本中检出鼠疫菌，这将遇到抑制物的问题。针对不同的样本建议采取不同的处理方法，如淋巴穿刺液、全血、脏器、痰液、咽拭子等标本可采取不同的方法。在我国，已经成功地直接在动物组织中利用PCR，确定该动物是否感染鼠疫。将动物组织制成匀浆，在沸水浴中处理10min，使用caf1或Pla基因引物，都可以成功地进行扩增。加热在这里同时起两方面的作用：它破坏了动物及鼠疫菌的细胞，使DNA释放出来；它也使标本中的蛋白质变性失活，消除了可能存在的PCR抑制物质。

在土壤中或其他存在大量污染的标本中，检出可能会遇到困难。如果加热仍不能解决问题，可试用酚／氯仿提取，以进一步除去可能抑制PCR的成分。然而，这些抑制因素常常为不可知的，必须使用有效的对照来监控假阴性结果。可以采用内部对照的方法，即使用经过改造的目标DNA模板。如以caf1基因为监测对象时，事先制备一种克隆的，并经内部删节，再插入另一种已知基因如16S rRNA基因片段的caf1基因序列。对这种模板以caf1引物扩增时，可产生长度明显不同的PCR产物。在实际监测中，除待查样品外，PCR混合物中额外加入少量这种经过改造的模板。这样，当结果为阳性时，应出现长度分别为原caf1基因和经过改造的caf1基因的2条带。只出现经改造的caf1基因带，为真正的阴性结果，而如果任何条带都不出现，则为需要进一步判断的假阴性现象。

4．防“带过”及假阳性的发生　在利用PCR进行监测时，常需要使用同一对引物，长期反复地对大量标本进行检测。由于各种意外的原因，前面出现的阳性结果的产物对工作环境造成的微量污染，就会在后面的检测中作为模板，引起大量的假阳性结果。这种情况在实际工作中非常容易出现，因此，在每一批实验中都必须设置阳性和阴性对照。PCR产物造成的假阳性，可以利用dUTP作为PCR的底物来解决。自然状态的DNA通常不含去氧尿嘧啶核苷酸。如果我们使用dUTP代替dNTP作为底物，它就能在PCR产物中出现在与腺嘌呤互补的位置上，从而使PCR产物与天然的模板DNA有所区别。这样，我们在进行PCR之前先使用尿嘧啶特异的－N－糖苷酶处理标本，标本中自然存在的DNA不受影响，而污染的PCR产物却因该酶水解了糖苷键，使尿嘧啶碱基脱落成为去嘧啶状态，不能作为合成的模板。利用这种方法，可以解决PCR产物污染引起的假阳性问题。

5．在鼠疫监测中利用PCR的前景　目前，在鼠疫监测中，主要可能在两个方面应用PCR技术。其一，是非典型鼠疫菌株的发现与鉴定。如果我们已经分离了典型的鼠疫菌株，用经典的方法鉴定其是否为鼠疫菌并不困难，也不需要再加入新的技术。然而，经典的方法存在一个问题。我们现在判定鼠疫菌的方法，叫做四步诊断，但具有决定性判定意义的，实际上只有一步，即噬菌体裂解试验。任何菌株，只要不能被诊断噬菌体裂解，就不能承认其为鼠疫菌。我们现在怀疑，有一些实际上确为鼠疫菌的细菌，由于不能被诊断噬菌体裂解，而被丢弃了。在这个意义上，我们确实需要新的方法来帮助我们识别用目前的技术手段无法认定的鼠疫菌株。鼠疫菌之所以能引起鼠疫，全赖其毒力决定因素。因而，编码毒力决定因素的基因，常为鼠疫菌高度特异的基因。目前，尚未发现已知的致病细菌携有如caf1或Pla等基因。因此，用PCR方法扩增这些基因，确是鉴别鼠疫菌的有效方法。我们可能会遇到一些似是而非的情况，如我们可以使用Pla基因引物扩增出一个条带，但这条带却不很清晰，或与已知的条带长度不一致。这时，我们怎样才能判断，这一菌株根本不是鼠疫菌，或其确为鼠疫菌，但确在我们所探测的基因中发生了突变？可以用不同的方法解决这样的问题。一种方法是，使用多对引物，扩增多个不同的基因。其逻辑根据是，一种不是鼠疫菌的细菌，可能带有与鼠疫菌Pla基因类似的序列，但它同时拥有Pla、caf1或其他一些鼠疫菌特有基因的机会，应该是微乎其微。因此，如果我们可以从一个菌株中扩增出两种以上的鼠疫菌特异基因序列，不管其是否符合鼠疫菌的形态特征或能否被诊断噬菌体裂解，均可认定其为鼠疫菌。

另一种方法是探针检测技术。首先在已知的鼠疫菌株中用同样的PCR技术获得已知的鼠疫菌特异性DNA片段，将这种片段标记成为探针，然后使其与可疑的PCR产物杂交。如果杂交阴性，则说明所获得的菌株只含有与引物相似的序列，而不具有真正的鼠疫菌基因；相反，如杂交结果阳性，那么，PCR扩增所得的，确为鼠疫菌特异的序列，只是可能存在变异，使引物结合困难，或片段的长度改变。另一方面的应用较为复杂。我们希望能利用PCR这样简单的方法，不经分离细菌，直接从标本中检出鼠疫菌的特异序列。如果我们能够实际应用这种方法，将会有一种非常有效的快速诊断手段，将非常有利于鼠疫的及时处理。然而，这样的方法目前仍在实验阶段，还存在着许多需要解决的问题。首先我们必须牢记，PCR只是用来确定是否存在鼠疫菌的特异序列，它不能帮助我们获得鼠疫菌株，而只有实际获得菌株，我们才获得了不会丢失的证据和继续研究的起点。因此，PCR永远也不能取代经典的细菌分离方法。

我们还必须记住，PCR的结果不能判断鼠疫菌是否仍然活着。我们还需要了解，动物或人感染了鼠疫之后，鼠疫菌的DNA究竟能够存在多长时间；存在于什么地方；当鼠疫菌被杀死之后，其DNA是否还能继续存在。只有对这些问题都有了明确的答案，PCR结果在鼠疫监测中的意义才能确定。除此以外，我们还会发现，PCR在现场的使用结果，并不像理论上预计的那样敏感。我们现在对环境中和宿主机体内的干扰和抑制物质，还没有明确的认识，也缺乏成熟的手段去克服这些障碍。在大规模使用时，假阳性问题也仍然是严重的问题。因此，还需要许多技术方面的工作，才能完成在监测中实际应用PCR的准备。不过，和PCR巨大的优越性比较起来，这些困难都值得去克服。我们相信，只有在实现了整个试验过程的标准操作规定（SOP）后，PCR才能真正在鼠疫监测中应用。

十、SiO₂纯化技术在鼠疫PCR扩增中的应用

F₁抗原是鼠疫菌共有且特异性的表面抗原成分，Galyov等1996年发表了F₁抗原基因的全序列；利用PCR方法体外扩增F₁抗原基因片断，并合成该基因的核酸探针，但检测对象都是鼠疫菌的纯培养物，对污染和腐败材料不能直接检测。PCR特异DNA分析诊断技术，敏感特异，简便快捷，是鼠疫病原体诊断的理想方法，因鼠疫送检的材料大部分都已污染和腐败，且成分十分复杂多变，清除被检材料中抑制物和阻止假阳性的发生，才能使PCR检测更具特异性。因此腐败材料中鼠疫菌DNA的纯化就成为该检测技术成败的关键。同时也适合于土壤样本的处理。

1．污染或腐败材料的处理　称取送检的污染或腐败材料200mg，磨碎后加入1ml PBS（pH7．4）中混匀。

2．SiO₂悬液的预制　称取SiO₂的固体粉末0．12g，装入1．5ml管，加入1．0ml灭菌去离子水，充分混匀，室温下静置24h，去除含有细小微粒的上清，加入8mol／L的KI溶液1ml，充分混匀，4℃保存备用。由于污染材料中可能会含有大量抑制PCR扩增的抑制剂，纯化的目的就是除去这些抑制剂，得到纯的DNA溶液。

3．SiO₂纯化污染DNA　取5ml的污染材料处理悬液，400r／min离心5min，把残渣沉到管底，转移上清液到另一离心管中，12000r／min离心10min，使上清液中的细菌沉到管底；弃去上清，加入200μl PBS悬浮沉淀，再加入5μl菌体裂解液，于37℃水浴保温30min，之后100℃煮沸5min灭活蛋白酶，即成污染材料裂解混合液，给120μl左右的裂解混合液中加入50μl SiO₂悬液和100μl 8mol／L KI溶液，充分混匀，静置吸附10min，5000r／min离心1min，弃去上清，加入80%乙醇洗涤，5000r／min离心1min，弃去上清，55℃烘干残留乙醇；加入100μl去离子水水洗脱DNA，5000r／min离心5min，上清即为纯化的DNA模板溶液，可以用于PCR检测。

4．PCR扩增及其检测PCR反应总体积30μl，其中DNA模板5μl，10×Reaction Buffer3μl，MgCl₂1．5mmol／L，Taq DNA聚合酶1U，引物各0．2μmol／L，dNTP各200μmol／L，取无菌双蒸水补足30μl。PCR循环条件为，94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环；循环完成后72℃5min延伸，取10μl扩增产物，常规琼脂糖电泳检测，在紫外凝胶成像系统下拍照记录，F₁基因长度PCR扩增后约540bp，Pla基因PCR扩增后为478bp，通过标准Mark，就可确定。