鼠疫菌蛋白质的提取及分析

第六章　鼠疫菌蛋白质的提取及分析

90多种病原菌及600多种病毒全基因测序的完成，标志着致病微生物后基因时代的开始。利用各学科的优势技术，确定各个基因所编码蛋白质的功能，标出毒力因子和具有保护宿主细胞功能的因子，为鼠疫疫苗的开发和寻找新药物的治疗奠定基础，为合理利用微生物资源提供帮助。一株东方型CO92鼠疫菌染色体序列4653728bp的长度，G＋C为47．64%，存在有4012个蛋白质编制程序基因（包括149pseudogenes）。鼠疫菌基因组中存在大量可重复插入序列（如IS100、IS285、IS1541、IS1661等），占了总基因长度的3．75%，其染色体基因组同时具有可流动的特征，特别是在体外培养过程中。研究发现在鼠疫菌基因组中，基因与酶的关系并不是一对一，一个超级基因家族的酶可以催化不同的反应，基因系列的相似性不总是意味它所编码的蛋白质能够催化类似的反应。此外，一种蛋白质可在不同的位点催化不同的反应。同时，同一种蛋白质在机体内不同时空所表现的不同四维构象，其性质也完全不同。如鼠疫菌Pla基因所编码蛋白，在28℃表现为凝固酶活性；37℃表现为纤溶酶活性。

耶尔森氏菌外膜蛋白调节图

一、鼠疫菌体蛋白的提取

可将鼠疫菌的表位蛋白划分为5部分：胞浆蛋白、内膜蛋白、胞浆周围蛋白、外膜蛋白和分泌蛋白。目前多采取超声波破壁及细胞粉碎和离心沉淀技术提取细菌蛋白质。由于外膜蛋白构成了细菌表面的受体蛋白和转运蛋白，具有重要的生物学功能。同时一种细菌特有的外膜蛋白可以反映出其种或型的生物学特征。45MD质粒为耶尔森氏菌属中3种致病菌共有，它参与温度与低Ca^2＋反应调节作用，主要分泌一些外膜蛋白（Yops）和产生具有抗吞噬作用的V抗原，这个质粒丢失后，鼠疫耶尔森氏菌将失去对低Ca^2＋反应的能力和相应的毒力。Yops分泌蛋白系统，由28种蛋白组成，包括分泌素。受温度控制调节，Yops是在细菌处于不利环境条件下合成和分泌的一系列毒力因子和调节蛋白，是通过Ⅲ型分泌系统直接将多种菌体效应蛋白转移到宿主细胞胞浆内，不需细菌侵入宿主细胞，能在宿主细胞外诱导调节。一类具有抗吞噬功能，另一类具有调节和定位攻击靶细胞的作用。其中YopJ可诱导多种细胞如巨噬细胞、上皮细胞凋亡，通过灭活NF－kb系统，导致抑制a肿瘤坏死因子和r干扰素的产生，从而诱导细胞凋亡。而YopE能干扰宿主细胞的信号传递通路，造成细胞肌动蛋白骨架的改变，抑制吞噬细胞的吞噬功能。

该质粒长约70kb，共有35个开放式读码结构，至少编码了28种蛋白成分。其中外膜蛋白11种，伴随性的护卫蛋白（Syc）至少6种；其中参与低钙反应的基因4个，参与温度调节反应的基因2个。Yops外膜蛋白的表达，受正（主要由VirF基因）、反（主要由LcrQ和YscM）两方面平衡的调节。最新的研究表明，其中SycF基因所编码的蛋白，对小鼠具有免疫保护作用。

Lcr基因组的排列及调节图

该毒力质粒赋予了鼠疫菌在宿主淋巴组织生存和增殖的本能。该系统由Yops蛋白和一个被称作Ysc的专一的Ⅲ型分泌装置组成。Yops在功能上分2类，其中一类是细胞内效应子（YopE、YopH、YpkA／YopO、YopP／YopJ、YopM、YopT），另一类（YopB、YopD、LcrV）构成转运装置，促使效应子穿过细胞质膜转运进入真核细胞。与真核细胞接触触发Yop分泌，控制分泌的是毒力子的一些蛋白，包括YopN、TyeA、LcrG，它们形成一个复合的栓塞关闭细胞分泌通道。系统的正常运作还需要细胞液中少量独特的蛋白伴侣，称为Syc护卫伴随蛋白。基因的转录同时受温度和分泌装置活性控制。

Lawton氏等（1960）研究，发现鼠疫有16种抗原，假性结核杆菌有13种抗原；在鼠疫菌和假性结核杆菌的抗原中有11种是两菌共有的，在共同抗原中又发现L抗原缺少免疫原性（1962年）。采用琼脂扩散的方法，研究在37℃下水解酪素培养的鼠疫菌，有28条沉淀带，并试图进一步纯分这些抗原进行研究。Hudson等用7%的聚丙烯酰胺凝胶，对鼠疫菌粉水浸液进行了电泳分析；见到了电泳图含有18～25条可见的蛋白带。选用5%～10%的阶梯式不连续凝胶浓度梯度分离胶，对我国不同疫源地分离的425株鼠疫菌菌粉分别用重蒸馏水浸泡，反复冻溶后超声波粉碎，收集上清液进行电泳，染色后可见到20～29条蛋白带；最多可达34条带。研究发现，电泳蛋白带扫描图峰型的差异，与菌株的地理分布有明显的规律性，与宿主也有一定关系。425株菌中的95%以上可根据电泳图的差异归纳为8类电泳图形。

粗制的鼠疫菌F₁抗原与几种近缘肠杆菌全菌免疫血清的Western blotting分析，其中12是粗提的F₁抗原，11是鼠疫的全菌抗原成分，10是假结核菌，1~9分别为其他几种近缘的肠杆菌，13是标准MARK

我国18个生态型的鼠疫菌37℃条件下培养（经超声破碎后超高速离心法提取蛋白，SDS－PAGE）电泳具有26条蛋白带；28℃条件下培养、电泳后具有36条蛋白带。其中内蒙古布氏田鼠型和青海田鼠型的鼠疫菌株都缺少32kDa蛋白带。虽然青海田鼠和内蒙古布氏田鼠鼠疫自然疫源地相隔甚远，其菌株在生化性状、营养要求以及质粒种类上基本相同，蛋白电泳条带上也基本一致。但内蒙古布氏田鼠鼠疫自然疫源地的菌株蛋白电泳条带上还具有一条特有的22kDa蛋白带。该蛋白条带是否具有特殊的流行病学意义，值得进一步研究。因为布氏田鼠鼠疫自然疫源地是我国唯一没有报道发生人间鼠疫病例的地区（虽有动物间鼠疫发生），可作为候选疫苗株及肽段疫苗考虑。

以蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温、剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓缩、干燥和保存。

微生物作为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料时有两种情况：①利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；②利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

二、蛋白质（包括酶）的提取方法

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

（一）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1～5倍，提取时需要均匀搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成分性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5℃以下）操作。为了避免蛋白质提取过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面着重讨论提取液的pH和盐浓度的选择。

1.pH蛋白质、酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

2.盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0．15mol／L浓度为宜。缓冲液常采用0．02mmol／L～0．05mmol／L磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的提脂蛋白的提取液，但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（50℃为10%，40℃为6．6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。如鼠疫菌内毒素—脂多糖（LPS）的提取。采用热酚（60℃）法提取的内毒素：D-葡萄糖、D-甘油-D-甘露庚糖、L-甘油-D-甘露庚糖、葡萄糖胺、3－脱氧辛酮糖酸、类脂A、3－羟基十四烷酸酯、乙酰基、磷和蛋白等。其中，糖的总量约占62%，类脂A约占29．2%。糖类除了D-甘油-D-甘露庚糖外，与一般肠杆菌科的脂多糖相一致。

三、蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有以下几种。

（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法

鼠疫菌F₁抗原的粗提

1.蛋白质的盐析　中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO₄²-和NH₄⁺）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

影响盐析的因素有：①温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4℃）下操作外，一般可在室温中进行。一般在低温条件下，蛋白质的溶解度会降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25℃）比0℃溶解度低，更容易盐析。②pH：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。③蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2．5%～3．0%。

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱和溶解度为4．1mol／L，即767g／L；0℃时饱和溶解度为3．9mol／L，即676g／L），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4．5～5．5之间，当用其他pH进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。鼠疫菌F₁抗原的提取可采用本方法。

蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断地更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

2.等电点沉淀法　蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3.低温有机溶剂沉淀法　用与水可混溶的有机溶剂，甲醇、乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出。此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

1.透析与超滤　透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。

超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的半透膜截留不同分子量的蛋白质。

2.凝胶过滤法　也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶。

（三）根据蛋白质带电性质进行分离

根据蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量的不同，可将其分开。

1.电泳法　各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2.离子交换层析法　离子交换剂有阳离子交换剂（如羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度的办法将吸附的蛋白质洗脱下来。

（四）根据配体特异性的分离方法

亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离、提纯和鉴定是生物化学中重要的一部分，至今还没有单独或一套现成的方法能够把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。如鼠疫菌F₁抗原的提取，在经硫酸铵盐析（粗提）后，再经亲和层析法，就可获取纯的F₁抗原。

四、细胞的破碎

1.超声波处理法　用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用的菌体浓度为50mg／ml～100mg／ml，在1kHz~10kHz频率下处理10～15min。此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感的核酸应慎用。

2.反复冻溶法　将细胞在－20℃以下冰冻，室温溶解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

3.化学处理法可　采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等破坏细胞膜，细菌细胞壁较厚，采用溶菌酶处理效果更好。

4.物理加压法　将细菌放在一个密闭的容器内物理方法加压到5～8大气压时，突然减压，使其膨胀，使细菌在瞬间细胞壁破裂，直接收集菌体成分，梯度离心后进行电泳。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

五、浓缩、干燥及保存

（一）样品的浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法如下。

1．减压加温蒸发浓缩　通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快。此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。

2．空气流动蒸发浓缩　空气的流动可使液体加速蒸发，铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不断蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。

3．冰冻法　生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地溶解，利用溶剂与溶质溶点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。

4．吸收法　通过吸收剂直接除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝胶等。使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇覆盖置于4℃下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。

5．超滤法超滤法　是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，当液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截留值（即大体上能被膜保留分子的最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成分及性质、溶液浓度等都对超滤效果有一定的影响。Diaflo超滤膜的分子量截留值如下表。

6.纤维过滤透析法　用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能，由于透析面积增大，因而使透析时间大大缩短。

（二）干燥

生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存。整个装置包括真空干燥器、冷凝器。在相同压力下，水蒸气压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干燥后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。

（三）贮存

生物大分子的稳定性与保存方法有很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年内无明显变化。贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0℃～4℃即可。液态贮藏时应注意以下几点。

1.样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。

2.一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。

3.贮藏温度要求低，大多数在0℃左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。

六、蛋白质组学的分析鉴定技术

蛋白质组学研究的核心是将组织或细胞内蛋白质进行分离和鉴定，从中找到与重大生命活动、疾病发生以及生物进化密切相关的关键蛋白质。这也是生命科学研究的重要内容之一。在分离的基础上对样品进行分析鉴定是整个研究过程中的一个重要环节。

（一）图像分析系统

获得蛋白质双向电凝胶后，要对凝胶图像进行备份保存，从而以数字化图像的形式存储下来，而且要尽量完整地保留定性和定量信息，以利于进一步的分析。蛋白电泳图像分析系统主要包括二维电泳图像采集系统和二维电泳凝胶分析软件；图像分析所要获得的信息包括每一块凝胶中所得到的总蛋白质点数、2-DE之间的批次重现性、蛋白质点的缺失和出现、多块胶之间蛋白质点表达丰度的定量变化等。

1.2-DE图像采集系统常用的采集系统有电感偶合装置（CCD）、光密度扫描仪、激光诱导荧光检测仪等。采集系统所具备的透射扫描功能，可以根据吸光度大小获得蛋白质点的光密度信息。一般来说，光密度值与蛋白质点的表达丰度成正比，下一步的图像分析就是在各蛋白质点密度值相对大小的基础上进行的，即图像采集质量的好坏直接关系到图像分析结果的可靠性。

影响图像采集质量的主要因素是采集系统中扫描透射功能的强弱（扫描系统的分辨率、灵敏度），以及扫描操作过程中所选择的图像对比度和明亮度。要保证扫描条件的重复性和获得图像的真实性，必须注意扫描强度的校正及各扫描参数（灰度值、对比度、亮度）设定的一致性。

2.2-DE图像分析系统

（1）双向凝胶电泳分析软件的工作原理：围绕每一个已经转化为数字化的图像信息——像素点，构建一个算子，比较算子中心和边缘的光密度值，比值达到一定强度时该中心点的像素即被认为是蛋白质点的一部分。一个完整的蛋白质点的检出需要此过程的若干次重复。经多年的发展，目前已形成了较为完善的图像分析系统。

（2）双向凝胶电泳分析软件的工作流程：蛋白质点的检测包括胶内点的定位、点的形状的确定、点的体积（蛋白质丰度）和面积的计算。该步骤是以后各步分析的基础，如果在后续分析中发现点的检测不完善，要重新执行点的检测，上一次点检测基础上的后续分析信息将被清除。因此，尽可能全面的检测，可以减短整个图像分析过程。

有两种点检测的方法：自动执行和手动执行。在背景清晰均匀的情况下，自动执行加上少量的编辑即可完成点的检测。但多数情况是，凝胶背景很不均一，自动功能很难完成点的检测，对于点密集区尤其如此。此时图像分析系统的手动向导可以引导分析者选择最佳的灵敏度、算子以及噪声参数，实现点的检测。

应指出，两种检测方法所得的结果都不可能一步到位，可能仍有一些点未被识别，其可能的原因有：污染物造成的“假点”、各点因距离过近被识别成一个点、因临近点的强度太高而被识别为背景掩盖等。对这些不足之处，图像分析软件提供了进一步的编辑功能，如画点、删点、点切割、提高峰值、边缘增加等，对软件所直接识别出的图像信息进行补充。

背景消减：点检测所得蛋白质点的体积，是该点各像素吸光强度值累加得到的，在凝胶背景较深时，这些背景值会被加到点体积中，从而使蛋白质点体积较实际值偏高。由此，软件中也提供了背景消减功能，包括手动消减和自动消减。若还不能满足要求，可以直接编辑某个点的背景水平。

归一化处理：目的在于对不同胶上的同一蛋白质点进行准确客观的相对定量。一般有两种模式：一种是以全部点体积之和为归一的基础；另一种是基于某一点的归一化处理，该点可以是已知的标志蛋白或人为添加的数值，无论哪种情况，必须保证此点在每一块胶上都存在，从而保证在不同胶上进行对比匹配。同理，此一步骤分析是否合理决定后续分析的可靠性。

蛋白质点匹配：第一步是创建参考凝胶，参考凝胶可以是待分析凝胶中的一张，也可以是几个凝胶合并而成的平均胶。匹配过程的两个重要参数是向量框和搜索框，用户可以通过改变这两个参数的大小来操纵匹配。此一过程也分为自动匹配和人工匹配。相应匹配参数的设置则根据实际需要进行调整。

其他：随着图像分析软件的不断完善，除上述基本功能外，各软件的数据校正功能可以排除非目标范围蛋白质所造成的干扰，减轻下一步网上蛋白质搜索的工作量；其统计处理和进化树分析功能，为蛋白数据库的建立提供了依据。

（二）蛋白质鉴定分析

经2-DE分离、染色，得到生物样品蛋白质表达谱后，需对蛋白质作进一步的分析鉴定，包括各蛋白质的氨基酸组成分析、蛋白质的定量分析、蛋白质的肽序列分析等。具体说来就是采用计算机图像分析技术，对所采集的蛋白图谱上的蛋白质点进行定位、定量、图谱比较、差异点寻找等。对胶上蛋白点的鉴定有两种不同的技术路线：一是将电泳分离开的蛋白质从胶上转印到膜上，然后用Edman降解或氨基酸组成分析等传统生物化学方法进行分析，进入特定的数据库检索系统，实现对蛋白质的鉴定；二是将胶上的蛋白质直接进行酶解，回收酶切片段，采用质谱技术，进入相应数据库检索，实现蛋白质的鉴定。以质谱为基本技术的蛋白质鉴定技术路线，以其灵敏度高、速度快、易实现自动化等特点，已成为蛋白质组研究中主要的蛋白质鉴定技术。

1．氨基酸组成分析在早期蛋白组学研究中有所应用，是一种传统的蛋白质化学分析法，它的通量和准确度难以满足蛋白质组学研究的需要。

2．质谱鉴定技术

（1）蛋白芯片技术：质谱技术中一个很关键的技术环节是蛋白芯片技术。蛋白质首先要被捕获并固定在芯片上，而后又经激光激发、电场加速和检测器的最终检测而获得质谱图。蛋白质芯片和基因芯片一样，同属于生物芯片的范畴，它一般包括2个基本组成部分。

①固相载体：硅、云母或各种膜片等经特殊处理后承载吸附各种生物制剂。

②固相载体上的各种生物制剂（探针），这些探针可以是某些蛋白的受体或抗体，结合特定离子的化学集团、免疫复合物、酶等。用化学固定法把这些物质固定在固相载体上。

与基因芯片不同，芯片上的蛋白质的三维结构要保持正确，从而保证它们和样品特异性的结合能力，这也是制备蛋白芯片最大的技术难题，一般采用机械手直接点样法，以避免蛋白质空间结构的改变。根据需要的不同，点样芯池的数目也不同。研究用芯片数目较少，规模生产用芯片池的数目则要大得多，所以芯片池的数目由数个到上千不等。现已有数种商品化的预制好探针的芯片系统。

（2）肽质量指纹图谱（PMF）

PMF基本原理：蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹谱。

由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。此外，根据肽段质量数变化，可对基因产生的插入、缺失、突变进行对比分析。从而可以从基因水平理解和阐释相关生理和病理机制，把基因组学和蛋白组学研究有机地结合起来。

基质辅助飞行时间质谱仪（MALDI－TOF－MS），是测定肽质量指纹图谱常用的仪器。它的基本原理是将分析物放在基质分子中并形成晶体，激光照射晶体时，基质分子吸收激光能量使样品解吸附，基质样品之间发生电荷转移使样品分子电离，基质吸收了激光大部分能量并气化，同时将样品分子带入气相，样品分子只吸收了少量激光能量，从而避免了分子化学键的断裂。MALDI源使用的激光是脉冲式的，每一脉冲激光产生的一批离子得到一张质谱图，通常使用的质谱图是多次脉冲激光扫描质谱峰结果的累加。产生的离子多为单电荷离子，图中的谱峰与样品有一一对应的关系；飞行时间检测器作为质量分析器，其分析范围很大，从几百道尔顿到100kDa都可以检测。离子化的生物大分子先经过一个加速电场，获得动能，再进入一个高真空无电场飞行管道，离子在此管道内以在加速电场所获得的速度飞行，质量较轻的离子飞行速度快，较早到达检测器，较重的离子飞行速度慢，较晚到达检测器。

最近发展起来的SELDI－TOF－MS技术系统，包括蛋白芯片、飞行质谱和分析软件三个部分，与MALDI有相似的工作原理。所不同的是，该系统能精确检测分析物的质量，分子量范围达0～500kDa；其蛋白芯片表面不同的化学成分用未知蛋白的检测及抗原抗体或配体不同亚型来区分；采用目前最先进的SELDI，使被测物离子化效应达到最高点，从而使蛋白检测的灵敏度、特异性和所需标本量及实验所需时间、实验结果的深度分析都有了进一步的提高，因而具有高通量筛选、小分子量低丰度粗样品检测等诸多特性。

（3）串联质谱数据鉴定蛋白质技术

串联质谱数据鉴定蛋白质的基本原理：蛋白质是由20种氨基酸组成的，一段3个氨基酸的肽段有20种可能的排列方式，含4个氨基酸的肽有20种可能的排列方式，也就是说，一个特定序列的4肽出现的概率为1/16万。由此可见，一个特定的5肽或6肽在一个蛋白质组中已具有很高的特异性，可以用来鉴定蛋白质，即可以把它们作为鉴定时的“标签”。它们的出现标志着含有此类特定肽段的肽段母离子的存在。

与PMF相比，肽序列谱图相对较为复杂，需要计算软件的帮助计算识别各系列的离子，从图谱中读出完整序列的解析较困难。数据库检索鉴定蛋白质时，可读出部分氨基酸序列结合此肽段序列前后的离子质量和肽段母离子质量，在数据库中查询，这一鉴定方法称为肽段序列标签技术（PST）。

七、蛋白质的折叠和细菌毒力

蛋白质现象是生命的基本现象。细胞内蛋白质多肽的翻译、折叠、多亚基装配、转运、加工及分泌是极复杂、十分有效、迅速的过程。通常认为具有毒力的微生物对宿主造成的损伤跟其毒力决定簇有关，这些毒力决定簇在感染的一个或多个阶段发挥重要作用，其中大部分为分泌性蛋白（如毒素）和细菌表面突起抗原成分。前者可直接给宿主细胞造成损伤，后者可介导病原菌与宿主细胞的直接结合，或具有保护微生物免遭宿主细胞的免疫的损伤。还有一类毒力基因产物，并不直接导致宿主的损伤，但却是其他一种或几种效应分子到达菌细胞外环境或直接进入宿主细胞所需的。而且，许多病原菌依靠一些通常认为不是毒力因子的分子伴侣和蛋白质折叠催化剂来合成它们的毒力决定簇。其中蛋白质折叠一直是生命科学研究的热点。

原核细胞如革兰氏阴性菌也具有有效的蛋白质折叠系统。以大肠杆菌为模型，近年来在胞浆和胞质中发现了多种折叠因子。由于胞质的特殊局部结构，包括内、外膜和膜间空隙，位于此间隙的折叠因子成为分子致病机制研究的重要对象。这是因为，经典的细菌毒力因子，如菌毛、黏附因子、侵袭因子及毒素等均为表面或分泌性蛋白。这些毒力因子需要在胞质中折叠成熟，表达于细菌表面，或分泌到胞外而发挥生物效应。细菌的蛋白折叠网络主要包括：二硫键催化酶（Dsb）、脯氨酸同体异构酶（PPI）、丝氨酸酶tegP、转录因子σ^E和信息传导系统CpxRA。

如上所述，在细菌胞质中存在多种因子组成的一整套胞质蛋白折叠网络。

八、蛋白质的空间构象与致病性

蛋白质的折叠结构示意图

国家标准与技术研究所（NISI）的研究者们已经解析了导致鼠疫的细菌中关键酶的结构，发现它有着极为不寻常的构象。这一结果会使我们搞清楚该细菌致死性之所在以及一些基础的细胞信号传导步骤。

NISI研究小组鉴定了第四类腺嘌呤环化酶（AC－IV）的三维构象。这种酶存在于鼠疫细菌——耶尔森氏鼠疫杆菌中，科学家们将这种酶纯化及结晶，在生物技术高级研究中心利用X衍射晶体学的方法解析了它的构象。它合成环磷酸腺苷（cAMP），这是一种重要的信号分子，会触发一系列细胞过程。目前已知六类腺嘌呤环化酶，这些酶发挥着广泛的作用。第二类AC是炭疽细菌致死机制的一部分，而第三类AC则触发了人体内肾上腺素的释放。

构象对决定一个蛋白的生物学功能发挥了决定性作用，但对于这样一种大分子而言鉴定其构象是一件相当困难的事情。AC的三维构象已知存在两种形式。NISI的实验发现了AC－IV存在着与前两者完全不同的构象。AC－IV以一种相当罕见的类似桶状的结构加以折叠，这种形式此前仅在3种无关蛋白中存在。

AC－IV在鼠疫中的作用尚未完全明了，但已知它在被感染的宿主中发挥着破坏细胞过程的角色。现在鼠疫不像中世纪时那样流行，当时它杀死了数以百万计的人。但目前世界卫生组织每年仍有1000～3000的病例报告，平均10～15例发生在美国。国家疾病预防控制中心和国家过敏与传染疾病研究所把鼠疫细菌列在最高等级生物威胁因子目录当中。关于这个酶的基础分子数据在研发有关鼠疫及其他病原体如炭疽菌，博尔代百日咳菌的抵御措施方面非常重要。不仅如此，关于AC－IV的结构和功能及其不同寻常的构象研究将使我们更深地理解cAMP的信号机制和其他基本的细胞过程。

根据国家CDC张建忠研究员对鼠疫相关的抗原及其抗体的质谱鉴定的结果可归纳如下：

鼠疫Blot阳性点蛋白特异性：

F₁（caf1）、caf1M、murine toxin、Pla、pesticin、putative lipoprotein（pMT054）

耶尔森菌特有蛋白：

其他菌属同源性小于70%～73%：4个

其他菌属同源性小于60%～69%：18个

其他菌属同源性小于50%～59%：7个

其他菌属同源性小于49%：8个

鼠疫菌特有蛋白的质谱鉴定

鼠疫菌F₁抗原质谱分析图

37℃培养EV菌抗原

37℃质谱鉴定参照胶