伏寒颗粒干预前后的血清代谢组学研究

6.2　伏寒颗粒干预前后的血清代谢组学研究

6.2.1　一般情况基线分析

本次研究对象中，各组均为10例，均为男性4例和女性6例;冠心病先天伏寒证组患者平均年龄为(52.36±3.56)岁;正常组平均年龄为(50.43±2.89)岁。经T检验分析，实验各组人口学资料无显著性差异，具有可比性。

2各组血清1 H－NMR图谱比较(图6.4)

图6. 4　各组典型的代谢谱图和相应的化学位移谱峰指认

注：A组为实验前组（即冠心病先天伏寒证组），C组为正常组，D组为实验后组（即冠心病先天性伏寒证给药组。）

图6.4为3组患者血清1 H－NMR图谱的整体比较图。下图所示的1 H－NMR图谱中可以观察到一些化合物，如丙酮(Act，2.23 ppm);乙酸(Ace，1.92 ppm);丙氨酸(Ala，1.48 ppm);肌酸(Cr，3.93 ppm，3.04 ppm);甘油(GL，4.27 ppm);谷氨酰胺(Gln，2.08 ppm，2.45 ppm，3.78 ppm);谷氨酸(Glu，2.35 ppm，2.45 ppm);甘油磷酸胆碱(GPC，3.36 ppm，3.23 ppm);高密度脂蛋白(HDL: L1，0.86 ppm; L2，1.28 ppm);低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白(LDL/VLDL: L3，1.58 ppm);脂类化合物(L4，1.99 ppm; L5，2.24 ppm; L6，2.74 ppm);乳酸(Lac，1.33 ppm，4.11 ppm);赖氨酸(Lys，1.71 ppm，3.01 ppm); N－乙酰糖蛋白(NAG，2.04 ppm);磷酸胆碱(PC，3.21 ppm，3.35 ppm);缬氨酸(Val，1.04 ppm，0.99 ppm);α－葡萄糖(α－Glc，3.42 ppm，3.54 ppm，3.71 ppm，3.73 ppm，3.84 ppm);β－葡萄糖(β－Glc，3.24 ppm，3.41 ppm，3.46 ppm，3.49 ppm，3.9 ppm)。

6.2.2　各组PCA积分图(图6.5)

以PC1/PC2矢量为坐标轴作图，得到二维得分图，可以反映类别间的差异，通过得分图我们可以观察各组数据的变化趋势。从图6.5中可以看出，大部分样本均存在于二维PCA得分图的95%的置信区间之内。各组之间有一定的分离趋势，但仍然有一定的交叉和重叠。大体来说，冠心病先天伏寒证与正常组沿PC1轴大致分开，冠心病先天伏寒证治疗前与治疗后沿PC2大致分开。说明NMR可以将各组区分开来，其代谢产物是有差别的，但差别不明显。

图6. 5　各组P C A积分图

6.2.3　治疗前与正常组间血清代谢物OPLS－DA积分图及负载图(图6.6)

从OPLS－DA积分图(a图)分析可以看出，冠心病先天伏寒证组治疗前与正常组(A组和C组)明显分开，2个组分别集中在椭圆形散点图(95%置信区间内)的左右两侧，二者之间无重叠，说明两组间存在明显的代谢差异。R² X= 71.3%，R² Y= 0.805，Q²= 0.683，两组模型预测性能稳定可靠。

从相应的负载图(b图)可以反映出实验组与对照组比较，血清样本内化合物所产生的1 H－NMR图谱的差异。从负载图我们可以看出，引起两组的差异的化学物质主要为高密度脂蛋白(L1，δ0.86; L2，δ1.28)、丙氨酸(δ1.48)、乳酸(δ4.11)、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白(L3，δ1.58)、谷氨酸(δ2.35，δ2.45)、谷氨酰胺(δ2.08，δ2.45，δ3.78)、α－葡萄糖(δ3.42，δ3.54，δ3.71，δ3.73，δ3.84)、β－葡萄糖(δ3.24，δ3.41，δ3.46，δ3.49，δ3.9)、N－乙酰糖蛋白(δ2.04)、脂类化合物(L5，δ2.24)等物质，与正常组相比，冠心病先天伏寒证组中丙氨酸、乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α－葡萄糖、β－葡萄糖、N－乙酰糖蛋白、脂类化合物等含量较高，而高密度脂蛋白含量则较低。

图6.6　两组血浆代谢物OPLS-DA积分图及负载图（a-积分图；b负载图）

6.2.4　治疗前后组间血清代谢物OPLS－DA积分图及负载图(图6.7)

从OPLS－DA积分图(a图)分析可以看出，冠心病先天伏寒证组治疗前组与治疗后组(A组和D组)分别集中在椭圆形散点图(95%置信区间内)的左右两侧，两组无明显交叉和重叠，这说明两组间代谢物可以区分。同时进行交叉验证得到R² X= 75.6%，R² Y= 0.815，Q²= 0.628的结果，提示两组模型预测性能稳定可靠。

从相应的负载图(b图)可以反映出冠心病先天伏寒证组治疗前组与治疗后组(A组和D组)比较，血清样本内化合物所产生的1H－NMR图谱的差异。从负载图我们可以看出，引起两组的差异的化学物质主要为高密度脂蛋白(L1，δ0.86; L2，δ1.28)、乳酸(δ4.11)、丙氨酸(δ1.48)、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白(L3，δ1.58)、N－乙酰糖蛋白(δ2.04)、谷氨酸(δ2.35，δ2.45)、谷氨酰胺(δ2.08，δ2.45，δ3.78)、α－葡萄糖(δ3.42，δ3.54，δ3.71，δ3.73，δ3.84)、β－葡萄糖(δ3.24，δ3.41，δ3.46，δ3.49，δ3.9)、脂类化合物(L5，δ2.24)等物质，与治疗前组相比，冠心病先天伏寒证患者治疗后组中高密度脂蛋白含量较高，而乳酸、丙氨酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α－葡萄糖、β－葡萄糖、脂类化合物、N－乙酰糖蛋白等物质含量较低。

图6. 7　两组血浆代谢物O P L S- D A积分图及负载图（a图-积分图；b图　负载图）

6.2.5　各组血清差异代谢物分析(表6.2)

通过分析各组代谢物相应的相关系数，对有统计意义的代谢物进行进一步归纳，得到引起组间差异的代谢物。结合上面图6.6、图6.7及下面的表6.2我们可以看出，与正常组相比，冠心病先天伏寒证组中丙氨酸、乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α－葡萄糖、β－葡萄糖、N－乙酰糖蛋白、脂类化合物等含量较高，有统计学意义(P＜0.05);而高密度脂蛋白含量则较低，有统计学意义(P＜0.05)。

与治疗前组相比，冠心病先天伏寒证患者治疗后组中高密度脂蛋白、丙氨酸含量较高，其中高密度脂蛋白与治疗前组相比有统计学意义(P＜0.05)，而丙氨酸与治疗前组相比无统计学意义(P＞0.05);而乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α－葡萄糖、β－葡萄糖、脂类化合物、N－乙酰糖蛋白等物质含量较低，其中乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α－葡萄糖、β－葡萄糖、脂类化合物与治疗前组相比有统计学意义(P＜0.05)，而N－乙酰糖蛋白与治疗前组相比无统计学意义(P＞0.05)。

表6.2　各组血清差异代谢物分析

注:│r│＞0.707为有显著性差异(P＜0.05);“－”为无显著性差异(P＞0.05)。

6.2.6　实验结果分析

代谢组学研究标的是生物机体的代谢变化客观终点，被认为是“组学”研究的最终方向，它对生物体内所有代谢物都可以进行分析，并通过描述生物体内代谢物动态变化参数，从而发现生物整体、系统或器官的代谢物变化的代谢途径和所受内在或外在因素影响与生理病理的关系。其主要研究对象为血液、尿液、乳液、脑脊液、唾液、组织萃取液等。目前代谢组学研究中用的体液主要是尿液和血清，由于尿液有近千种代谢物，而血清仅有近百种代谢物，易于分析，发现有价值的特征代谢谱。

在既往先天伏寒证的研究中主要局限于单一某个系统的指标选择，这样的研究难以全面反映中医证候的整体状态。本研究采用代谢组学方法，从整体观出发，以正常组为对照，寻找差异性代谢物，并试图通过药物干预前后的差异分析，全面解析机体产生变化的病理本质。

从图6.5和图6.6中，我们可以看到两组分别集中在椭圆形散点图(95%置信区间内)的左右两侧，二者之间无重叠，两组间存在明显的代谢差异。因此可以得出结论:代谢组学技术能够很明显的区分先天伏寒证病人和正常对照组的血清代谢物，通过对差异代谢物组分的分析、判断，可以更好的理解冠心病先天伏寒证的病变过程及机体内物质的代谢途径和代谢状况，初步寻找到先天伏寒证的代谢表型与生物标志物。

6.2.6.1　冠心病先天伏寒证代谢特征分析

通过分析我们可以看出，冠心病先天伏寒证组与正常组的差异代谢物主要是:高密度脂蛋白( L1，δ0.86; L2，δ1.28)、丙氨酸(δ1.48)、乳酸(δ4.11)、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白(L3，δ1.58)、谷氨酸(δ2.35，δ2.45)、谷氨酰胺(δ2.08，δ2.45，δ3.78)、α－葡萄糖(δ3.42，δ3.54，δ3.71，δ3.73，δ3.84)、β－葡萄糖(δ3.24，δ3.41，δ3.46，δ3.49，δ3.9)、N－乙酰糖蛋白(δ2.04)、脂类化合物(L5，δ2.24)，其中乳酸是葡萄糖在无氧酵解条件下由丙酮酸降解而产生的，同时伴有三磷酸腺苷的生成。生理状态下不作为主要供能途径，血中乳酸维持动态平衡。心肌供血不足，使心肌摄入氧下降，细胞得不到充分氧供，三羧酸循环反应受到抑制，产生减少，糖酵解增强，可造成乳酸堆积。因此乳酸水平的异常提示机体能量代谢失调。

与正常组相比，冠心病先天伏寒证患者存在着明显的脂代谢异常。主要表现在脂类化合物，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白。流行病学研究表明，高密度脂蛋白胆固醇含量与冠心病呈负相关，低密度脂蛋白胆固醇含量与冠心病呈正相关。本研究中，与正常组相比，冠心病先天伏寒证组中高密度脂蛋白含量较低，低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白含量较高，与流行病学研究结果一致。

谷氨酞胺是体内含量最丰富的非必需氨基酸，约占体内总游离氨基酸的50%，它的变化直接影响机体总氨基酸的代谢，在体内许多代谢途径上发挥重要作用，谷氨酰胺参与分解代谢，使组织对分解代谢、炎症和感染作出最佳反应，因此具有免疫增强效应;谷氨酰胺也被称为机体在应激状态下的“条件必需氨基酸”，对于调节应激状态下细胞代谢和免疫细胞功能有重要意义。是淋巴细胞分泌、增殖及其功能维持所必需的氨基酸。而由谷氨酰胺转化生成的谷胱甘肽有非常重要的抗氧化、抗损伤作用，在细胞的自我修复、抗衰老、抗凋亡方面具有非特异性保护作用。丙氨酸是体内重要的非必需氨基酸，丙氨酸是淋巴细胞再生及免疫过程中重要的参与者。

N－乙酰糖蛋白的出现，说明凝血机制出现异常。因为参与血液凝固过程的纤维蛋白原、凝血酶原和几种凝血因子都是糖蛋白。有研究表明乙酰糖蛋白谱峰的改变可能是高脂血症大鼠模型血瘀的早期生物标记物。同时N－乙酰糖蛋白在调节物质能量代谢，免疫调节等方面有重要作用。

综上分析，冠心病先天伏寒证存在着能量代谢、糖脂代谢、免疫调节等多种代谢通路的异常，是整体多个系统功能共同改变的结果。血清这些代谢物的改变，说明在“先天伏寒证”状态下，存在着能量代谢异常，供能不足(虚寒)、凝血功能异常(气滞血瘀)、脂类代谢异常(痰浊)、免疫功能异常(热证客观化指标)等一系列表现，这种虚实夹杂、寒热错杂的表现与先天伏寒证的证候特点一致，因此我们认为高密度脂蛋白、丙氨酸、乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α－葡萄糖、β－葡萄糖、N－乙酰糖蛋白、脂类化合物有可能可以成为冠心病先天伏寒证的潜在生物标记物。

当然，本研究中代谢组学提供的信息显然不能完全涵盖先天伏寒证状态下所有改变的物质，全面的阐释先天伏寒证的本质及科学内涵，还需要进一步完善检测手段，加大临床研究样本，完备数据库。

6.2.6.2　伏寒颗粒干预后差异代谢物分析

本研究结果表明，与治疗前组相比，冠心病先天伏寒证患者治疗后组中高密度脂蛋白、丙氨酸含量较高，其中高密度脂蛋白与治疗前组相比有统计学意义(P＜0.05)，而丙氨酸与治疗前组相比无统计学意义(P＞0.05);而乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α－葡萄糖、β－葡萄糖、脂类化合物、N－乙酰糖蛋白等物质含量较低，其中乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α－葡萄糖、β－葡萄糖、脂类化合物与治疗前组相比有统计学意义(P＜0.05)，而N－乙酰糖蛋白与治疗前组相比无统计学意义(P＞0.05)。这说明伏寒颗粒对乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α－葡萄糖、β－葡萄糖、脂类化合物、高密度脂蛋白等物质含量改善明显，但对丙氨酸、N－乙酰糖蛋白改善不明显。因此我们认为伏寒颗粒可以调整冠心病先天伏寒证患者的糖脂、能量代谢，并使之代谢网络呈现向正常状态修复的趋势，这可能是伏寒颗粒治疗冠心病先天伏寒证的作用机制，复方药物大都是通过多层次、多系统、多靶点的整合作用协调干预人体的内源性代谢物组来治疗疾病，伏寒颗粒详细的作用机制则仍需进一步扩大样本，深入研究。

根据冠心病先天伏寒证与非先天伏寒证及与健康人的差异代谢物分析，结合本研究结果的佐证，我们可以认为冠心病先天伏寒证的生物标记物是低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、脂类化合物、谷氨酸、谷氨酰胺、α－葡萄糖、高密度脂蛋白。代谢组学技术为先天伏寒证候标准化的研究可能探索出一个新的方向。