细菌的分离培养

实验三　细菌的分离培养

一、目的要求

1．了解细菌分离纯化的原理及学会常用的细菌分离纯化方法和应用。

2．熟悉细菌接种用具、接种细菌的环境要求和无菌操作要领。

3．熟悉细菌生长的观察。

二、实验原理

自然界中的微生物几乎都是杂居在一起的。纯种分离是从含有多种微生物的材料中通过一定的方法，使它们由单个菌体在固体培养基上繁殖成一个菌落，此菌落即为纯种。在分离纯化细菌时，除采用适宜的培养基（选择性培养基）外，还需要考虑欲分离纯化菌种的其他培养条件，如温度、气体环境等。

分离纯化细菌的方法有多种，常用的为平板划线分离法和稀释分离法，有条件的单位也可用显微操纵器单细胞分离。

平板划线分离法是由接种环以无菌操作蘸取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，使单个菌体能固定在一点，生长繁殖后形成单个菌落，从而达到分离纯化的目的。连续划线常用于材料中菌量少的分离；菌量多的材料则以分区划线为宜。

接种环由环、金属柄和绝缘柄3部分组成。环部分以白金丝制成为佳，因其硬度适宜，易传热散热，火焰灭菌后冷却快，不易生锈、经久耐用，但因其昂贵，通常用300～500W电热（镍）丝代替。环直径为2～4mm，长5～8cm。标准接种环是取斜面上大肠埃希菌菌苔，充满环的空间，在分析天平上称重，环内湿重菌量恰为2mg。标准接种环可用于制备一定浓度的菌悬液或定量接种。接种针（环）通常用酒精灯或煤气灯烧灼灭菌。

稀释法是先将待分离的材料用无菌水做一系列的稀释，然后分别取不同稀释液少许，涂布在琼脂平板上，如果稀释得当，培养后可出现分散的单个菌落，达到分离纯化的目的。涂布接种需要用涂布棒，涂布棒通常用牛皮纸包扎后高压灭菌或蘸取无水乙醇后在火焰上烧灼。

三、实验内容及方法

（一）连续划线分离法（一人一块）

1．材料。

菌株：表皮葡萄球菌和大肠埃希菌的混悬液。

培养基：营养琼脂。

其他：灭菌培养皿、接种环、培养箱等。

2．方法。

（1）制平板。溶化培养基冷却至50℃左右，倒入平皿，制成平板。

（2）烧灼接种环。点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属环端，再直接烧灼金属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，然后再反方向通过火焰，如图1－3所示。如此操作2～3次。

图1－3　烧灼接种环示意图

（3）接种环待冷却后，取菌种管打开盖子，接种环先接触一下未长菌的培养基，充分冷却后挑取一环菌液。

（4）取反置的琼脂平皿（底部朝上）一个，置于酒精灯附近，左手抓平皿的底部边缘，反转过来（盖朝上），用食指压住平皿盖的一处边缘，再用大拇指和中指撑起平皿盖，呈约45°的斜度，右手持接种环与平板面成30～40°角，来回以密而不重叠的曲线做连续划线接种，将整个平板布满曲线。如图1－4所示。

图1－4　连续划线分离法（a）及培养后菌落分布（b）示意图

（5）划线完毕，盖上培养皿盖，做好标记，注明接种菌名、接种者姓名及接种日期。

（6）培养皿倒放（即皿底在上，盖在下，这样可避免培养过程中凝结水自皿滴下，冲散菌落），37℃培养箱培养24h。

3．结果记录及分析。

观察接种线上生长的细菌是否形成单个菌落，有几种不同菌落，对不同特征的菌落略加描述。

判断是否达到分离纯化的目的。

（二）分区划线分离法（一人一块）

1．材料。

菌株：表皮葡萄球菌和大肠埃希菌的混悬液。

培养基：营养琼脂。

其他：灭菌培养皿、接种环、培养箱等。

2．方法。

（1）将平板如图1－5所示，进行粗略分区。

（2）将接种环通过火焰灭菌，待冷却后取一环菌液。

（3）左手拿琼脂平板培养基，略开盖，将菌液于平板一侧边缘开始做连续划线，约占平板的1/10，作为1区。

（4）将接种环灭菌，冷却后，转动培养皿约70°角，做2区划线。2区划线与1区划线相交约120°，约有3～5条线通过1区。

（5）同法划3、4区。4区与1区不能交叉。

（6）接种完毕，将平板盖好，做好标记，倒置放入37℃培养箱中18～24h，观察琼脂平板表面生长的菌落特征。

3．结果记录及分析。

观察分区是否合理、清晰，接种线有无交叉；接种线上生长的细菌是否形成单个菌落，有几种不同菌落，对不同特征的菌落略加描述。

判断是否达到分离纯化的目的。

图1－5　分区划线分离法（a）及培养后菌落分布（b）示意图

（三）稀释涂布分离法

1．材料。

菌株：待分离样本。

培养基：营养琼脂。

其他：营养琼脂平板、无菌试管、移液管、涂布棒、培养箱等。

2．方法。

（1）取5支无菌试管编号为10－1，10^－2，10^－3，10－4，10－5，每管加入9mL无菌水。用一支1mL无菌吸管从待分离样本液中吸取1mL加入编号10^－1试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL加入10－2试管中，混合均匀，以此类推，制成不同稀释度（10^－1，10^－2，10^－3，10^－4，10^－5）。（10倍梯度稀释）。

（2）选取合适稀释度的稀释液进一步实验。无菌条件下分别吸取稀释液0．2mL至平板中央。

（3）左手持平板，右手拿无菌涂布棒，将涂布棒平放于培养基表面，将菌液在平板上涂抹均匀，最后在平板的周围刮一圈。

（4）室温下静置5～10min，使菌液吸附进培养基。

（5）培养：平板倒置于37℃培养箱中培养24h。

3．结果记录及分析。

观察是否形成单个菌落，有几种不同菌落，对不同特征的菌落略加描述。

后续实验可将培养后长出的单个菌落分别挑取少许平板划线再一次进行分离、纯化，待长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。

四、思考与讨论

1．分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）。例如：链球菌在普通琼脂上不生长，加血清或血液才能生长。大肠埃希菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。

2．防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。

3．防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即挑取细菌材料，应在酒精灯旁晾凉；另外还应注意防止已挑取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。