实验四 纯种细菌培养法
一、目的要求
1．掌握常用的微生物纯种接种技术及应用。
2．掌握无菌操作。
二、实验原理
细菌经分离纯化后，常常需要接种至有关的培养基进一步扩大培养或者进一步进行生化反应，此时需要用纯种的接种技术。纯种细菌的接种技术主要有平板接种、斜面接种、液体接种、半固体接种等方法。
平板纯种培养一般可用于增菌、药敏检测等；斜面常作为菌种传代或观察其某些生化特性之用；液体培养基接种后，大多数供测定生化特性或用于增菌等；半固体接种用于观察细菌有无动力或菌种保存等。
三、实验内容及方法
（一）平板密集划线法接种（一人一块）
1．材料。
菌株：表皮葡萄球菌、大肠埃希菌。
培养基：营养琼脂。
其他：接种环、培养箱等。
2．方法。
（1）无菌操作取菌种。
（2）在平皿中心划一“＋”字。
（3）然后平行密集划线划满平板。
（4）将平板转90°，重复平行密集划线。共转3次。
（5）盖上皿盖，做好标记，倒置放入37℃培养箱中培养18～24h。
3．结果记录及分析。
观察接种线是否密集，生长的细菌是否均匀分布于培养基上；有无杂菌污染（对污染的杂菌略加描述）。
（二）平板棉签涂布法接种（一人一块）
1．材料。
菌株：表皮葡萄球菌、大肠埃希菌。
培养基：营养琼脂。
其他：无菌棉签、培养箱等。
2．方法。
（1）用无菌棉签蘸取菌液，在管壁上挤去多余的液体。
（2）用棉签在平板上做密集划线。划完线后在平板的周围刮一圈。
（3）盖上皿盖，做好标记，倒置放入37℃培养箱中培养18～24h。
3．结果记录及分析。
观察有无细菌生长，生长的细菌是否均匀分布于培养基上；有无杂菌污染（对污染的杂菌略加描述）。
（三）斜面接种
1．材料。
菌株：表皮葡萄球菌、大肠埃希菌。
培养基：营养琼脂斜面。
其他：接种环、培养箱等。
2．方法。
（1）左手手指（拇指与食指、中指及无名指）握持菌种与待接种斜面，一般菌种管在左。
（2）右手执接种环烧灼灭菌，待冷后右手拔取并夹持试管盖，将两管口迅速通过火焰烧灼。
（3）已灭菌接种环伸入菌种管，先接触培养基表面上无菌生长处使环冷却，再挑选生长较好的菌苔少许，移至无菌斜面，自斜面底部表面上划一直线，再自底部向上做蜿蜒划线。结束后取出接种环，烧灼两管口，盖回管盖。接种环烧灼灭菌后放回。如图1－6所示。
图1－6 琼脂斜面培养基接种法
（4）37℃培养箱中培养24h，观察结果。
3．结果记录及分析。
观察有无细菌生长，生长的细菌是否形成菌苔，记录菌苔的颜色、光泽、透明度等；有无杂菌污染（对污染的杂菌略加描述）。
（四）固体培养物接种至液体培养基
1．材料。
菌株：表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌。
培养基：肉汤培养基。
其他：接种环、培养箱等。
2．方法。
（1）左手握含菌的斜面培养管及液体培养管下端，1管在左，斜面向上，2管在右。右手持接种环并以无名指与小指夹住前管棉塞，小指与手掌夹住后管棉塞，在火焰旁拔开，管口灭菌。
（2）将灭菌过的接种环插入斜面培养管，冷却后取菌苔少许立即移入液体培养管。接触液面，沿管壁研磨数次，使细菌混于液体中。管口再次通过火焰灭菌，塞好棉塞，做好标记。轻轻摇动使菌种均匀分散在液体培养基中。如图1－7所示。
图1－7 固体培养物接种至液体培养基
（3）置37℃培养箱培养18～24h，观察结果。
3．结果记录及分析。
轻轻摇动培养基，观察有无细菌生长。
（五）液体菌种接种至液体培养基
1．材料。
菌株：表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌。
培养基：肉汤培养基。
其他：接种环、培养箱等。
2．方法。
（1）用灭菌过的移液管吸取0．2mL菌悬液，加入液体培养基中，摇匀。
（2）置37℃培养箱培养18～24h，观察结果。
3．结果记录及分析。
轻轻摇动培养基，观察有无细菌生长。
（五）半固体穿刺接种
1．材料。
菌株：表皮葡萄球菌、甲型副伤寒杆菌（一人做一种菌）。
培养基：半固体培养基。
其他：接种针、培养箱等。
2．方法。
（1）用接种针同斜面接种法取少量菌种。
（2）菌种移至半固体培养基管中，刺入半固体培养基中心直至接近管底，循原路退出。烧灼管口，盖回盖子。接种针烧灼灭菌后放回。如图1－8所示。
（3）37℃培养箱中培养24h，观察结果。
图1－8 半固体培养基穿刺接种法
3．结果记录及分析。
观察接种线路上有无细菌生长，接种线路是否清晰。
四、思考与讨论
1．整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。有条件的实验室可在超净工作台内进行。
2．接种环使用前后均须灭菌处理。一般采用火焰灭菌法。
3．从培养瓶或试管培养物中取标本或移种时，在打开或关闭前，瓶口、管口均要在火焰上通过2～3次灼烧。切不可将含菌材料污染台面和其他物体。
4．工作完毕后，用紫外光灯照射30min，或用3%来苏尔擦拭台面，并清洗双手。
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