细菌涂片的制备及染色

实验六　细菌涂片的制备及染色

一、目的要求

1．掌握细菌涂片的制备方法。

2．掌握简单染色和革兰染色。

3．了解芽胞、鞭毛等特殊结构的染色方法。

二、实验原理

细菌染色后可清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。多采用美蓝、结晶紫或碱性复红等碱性染料。这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中细胞通常荷负电，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分荷正电（酸性染料电离时，其分子的染色部分荷负电），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

革兰染色法是细菌学中最重要的鉴别染色方法，1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。根据细菌细胞壁的差异，染色后可将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。其基本步骤是先用初染剂结晶紫染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂复染。

当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物。使用乙醇或丙酮脱色处理时，革兰阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，遇乙醇或丙酮，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内；而革兰阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后呈无色。用复染剂复染后，革兰阳性菌呈现初染剂和复染剂的叠加颜色，革兰阴性被染上复染剂的红色。为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。本实验介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰染色法。

细菌的特殊结构，需要用特殊染色方法。如芽胞，具有厚而致密的壁，折光性强、通透性低，不易着色，用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（呈透明）。芽胞染色法根据芽胞具有既难以染色而一旦染上后又不易脱色的特点而设计的。所有的芽胞染色都基于同一原则，即除了用着色力强的染料外，还需加热促进标本着色。然后使菌体脱色而芽胞上的染料仍保留。经复染后，菌体和芽胞呈不同的颜色。荚膜与染料的亲和力弱、不易着色，且可溶于水易在水洗时被除去，所以通常用衬托染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。细菌的鞭毛不能用光学显微镜直接观察到，染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。

三、实验内容及方法

（一）涂片制备

1．材料。

菌种：大肠埃希菌24h培养物，表皮葡萄球菌24h培养物。

其他：接种环、玻片、生理盐水等。

2．方法。

（1）制片。取1张清洁无油的载玻片，以红蜡笔中线分开成两等份。用接种环无菌取灭菌生理盐水置载玻片两边（每边各一环）。无菌挑取表皮葡萄球菌少许，与载玻片一边的生理盐水混匀，涂布成直径1cm大小的均匀薄膜涂片（若采用液体培养物，不用生理盐水，直接用接种环取1～2环菌液涂片即可）。再以同样方法在玻片另一边制作大肠埃希菌涂片。接种环烧灼后插入试管架上。（如液体培养物，可取一环菌液直接涂于玻片上即可。）

（2）干燥。涂片室温自然干燥。

（3）固定。手持玻片一端（即涂有薄菌膜片的远端），标本面向上，在火焰外层较快地来回通过3次，温度不能太高，以玻片的温度达到皮肤所能耐受的温度为宜，放置待冷后进行染色。固定的目的是使细胞质凝固以固定细胞形态，使菌体较牢地黏附于玻片上；改变细菌对染料的通透性，因活的细菌一般不易着色。注意温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。

（二）简单染色法

1．材料。

菌种：大肠埃希菌、表皮葡萄球菌斜面18～24h培养物。

染液：稀释复红液。

其他：显微镜、接种环、载玻片、纱布、滤纸本、镜油、二甲苯、蒸馏水。

2．方法。

（1）涂片制备：涂片、干燥、固定。

（2）染色：滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜），保留染液1～2min。

（3）水洗：倒去染液，用自来水小水流冲洗，至涂片上流下的水无色为止。

（4）干燥：自然干燥或吸水纸吸干。

（5）镜检：用油镜观察。

3．结果记录及分析。

观察稀释复红染色后的表皮葡萄球菌和大肠埃希菌，并加以比较，绘制染色后的细菌形态图。

（三）革兰染色观察

1．材料。

菌种：大肠埃希菌、表皮葡萄球菌斜面18～24h培养物。

染液：革兰染色液。

其他：显微镜、接种环、载玻片、纱布、滤纸本、镜油、二甲苯、蒸馏水。

2．方法。

（1）涂片制备：涂片、干燥、固定。

（2）初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1min，水洗。

（3）媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

（4）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，一般0．5min，立即水洗。

（5）复染：滴加稀释复红染0．5min，水洗，吸干。

（6）镜检：用油镜观察。

3．结果记录及分析。

观察革兰染色后的表皮葡萄球菌和大肠埃希菌的颜色，比较阳性菌与阴性菌的染色效果；比较稀释复红单染与革兰染色的颜色。

绘制染色后的细菌形态图，标注细菌名称、染色方法、显微放大倍数。

（四）芽胞染色法

1．材料。

菌种：大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌。

染液：芽胞染色液。

其他：显微镜、接种环、载玻片、纱布、滤纸本、镜油、二甲苯、蒸馏水。

2．方法。

（1）细菌培养物常规涂片、干燥后，火焰固定。

（2）滴加5%孔雀绿水溶液于涂片上，用微火加热至染料冒蒸气（切勿煮沸）维持3～5min，加热过程要随时添加染液，勿让标本干涸，待玻片冷却后，水洗。

（3）用0．5%沙黄水溶液复染0．5～1min，水洗，待干后镜检。

3．结果记录及分析。

芽胞染呈绿色，菌体呈红色。

绘制观察到的细菌及芽胞形态，标注细菌名称、染色方法、显微放大倍数。

（五）鞭毛染色法

1．材料。

菌种：变形杆菌（1%的软琼脂上传两代，形成迁徙生长现象）。

染液：鞭毛染色液。

其他：显微镜、接种环、载玻片、纱布、滤纸本、镜油、二甲苯、蒸馏水。

2．方法。

（1）取洁净玻片1张，于玻片一侧滴加蒸馏水1滴，然后取上述迁徙生长边缘的细菌少许，轻轻点于蒸馏水中，不要研磨，以免鞭毛脱落。缓慢倾斜玻片，使菌顺水流自然扩散，将玻片置37℃温箱内让其自然干燥，切勿火焰固定。

（2）染色方法：于标本上滴加鞭毛染液，染色0．5～1min，轻轻水洗，干后镜检。

3．结果记录及分析。

菌体与鞭毛均呈红色，且菌体着色比鞭毛深。染色时间越长，鞭毛越粗。绘制观察到的细菌形态及鞭毛，标注细菌名称、染色方法、显微放大倍数。

（六）荚膜染色法

1．材料。

菌种：肺炎链球菌。

染液：荚膜染色液。

其他：显微镜、接种环、载玻片、纱布、滤纸、镜油、二甲苯、蒸馏水。

2．方法。

（1）制片。提前数日于小白鼠腹腔注射肺炎链球菌0．2mL，小鼠死亡后解剖，取腹腔液印片。印片在空气中自然干燥，无须加热固定。

（2）染色方法。

滴加结晶紫染液，于火焰上加温染色，至冒蒸汽为止，勿水洗。

以20%CuSO₄，溶液冲洗染液，勿水洗，干后镜检。

3．结果记录及分析。菌体呈现紫色，荚膜呈淡紫色。绘制观察到的细菌形态及荚膜，标注细菌名称、染色方法、显微放大倍数。

四、思考与讨论

1．革兰染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰阴性菌也会被染成革兰阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。

2．染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

3．选用幼龄的细菌。G＋菌培养12～16h，大肠埃希菌培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰阳性菌转呈阴性反应。