实验九 抗菌药物敏感性试验
一、目的要求
1．掌握纸片琼脂扩散法（K－B法）的原理、操作方法、结果的判读及临床意义。
2．了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判读和临床意义。
3．掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量控制。
二、实验原理
抗菌药物一般指具有杀菌或抑菌活性的药物，包括β－内酰胺类（青霉素类、头孢菌素类、头孢霉素类、亚胺硫霉素、单环内酰胺类及β－内酰胺酶抑制剂）、氨基糖苷类、大环内酯类、林可霉素类、四环素类，以及磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等。细菌引起的感染用某种抗菌药物常用推荐剂量通过恰当治疗可达到治疗目的称为敏感；常规剂量药物在组织内或血液中达到的浓度不能抑制细菌的生长，称为耐药。
目前临床微生物实验室主要通过体外药敏试验来预测细菌耐药。体外试验敏感和耐药的标准，是由所谓的折点来界定的，折点是细菌耐药的机制、抗菌药物的药动学和药效学、临床的相关性做出的规定，CLSI/NCCLS不断根据临床的资料更新折点的界定。体外药敏试验测定的是药物对病原体的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）或抑菌圈直径，药敏试验的折点遵照每年最新公布的CLSI标准进行。
常用的药敏试验方法有：纸片琼脂扩散法（K－B法）、稀释法、E试验等。
纸片琼脂扩散法（K－B法）：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种细菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后，便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映了细菌对药物的敏感程度，并与该药对细菌的MIC正负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
液体稀释法是用水解酪蛋白（MH）培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后接种待测细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的MIC。
E试验是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量的技术。E试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度，对照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。如图1－23所示。
图1－23 E试验结果
三、实验内容及方法
（一）纸片扩散法（Kirby－Bauer法）
1．材料。
菌种：金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、待检菌各1支。
培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）。
抗菌药物纸片：红霉素（红）、氯洁霉素（洁）、氯霉素（氯）、痢特灵（痢）、复方新诺明（复）、多黏菌素（多）、麦迪霉素（麦）、先锋必素（必）、头孢呋肟（西）、新霉素（新）、菌必治（菌）、先锋霉素IV（IV）、先锋霉素VI（VI）、先锋霉素V（V）、卡那霉素（卡）、丁胺卡那霉素（丁）、庆大霉素（庆）、青霉素（青）、苯唑青霉素（苯）、羧苄青霉素（羧）、氨苄青霉素（氨）、氧哌嗪青霉素（氧）、强力霉素（强）、万古霉素（万）、四环素（四）、氟哌酸（氟）、氧氟沙星（氟嗪酸）（嗪）、丙氟哌酸（环）、复达欣（达）、奥复星（奥）、美满霉素（满）、利福平（利）等。
2．方法。
2人/组，甲做金葡，乙做大肠，每菌随机做2纸片（两种药）。
（1）菌悬液制备：挑取孵育16～24h的血平板上数个菌落置于生理盐水管中，校正浓度至0．5麦氏标准。
（2）用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方式均匀涂抹琼脂平板表面3次（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上皿盖，放置5min。
（3）用无菌镊子将抗菌纸片粘贴于M－H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
（4）37℃孵育16～18h。
（5）观察结果。
3．结果记录及分析。
（1）量取并记录抑菌圈直径：抑菌圈直径包含纸片宽度；若抑菌圈为椭圆的话，计算长与宽的平均值。
（2）根据CLSI标准，判定细菌对该抗生素是敏感（S），还是耐药（R），抑或中介（I），并说明判定依据。
（3）标准菌株的抑菌圈应在预期范围圈内。如果超出该范围，须及时查找原因，予以纠正。
（二）琼脂稀释法
1．材料。
菌种：金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、待检菌各1支。
培养基：水解酪蛋白琼脂。
其他：待测抗菌药物等。
2．方法。
（1）抗菌药物的配制：原液配制好后用过滤法除菌，小量分装备用。根据需要进行稀释。琼脂稀释法常用的原液浓度一般为5120μg/mL。
（2）含药琼脂的制备：分别取2mL不同稀释度的抗菌药，加入一系列已做好标记、内径为90mm的平板内，再取融化后已在50℃水浴中平衡0．5h的M－H琼脂18mL加进平板内，边加边摇晃平板，使药物和培养基充分混匀。
（3）接种：平板凝固后，逐个接入待检菌。可在平板上划定区域后用1～2μL定量接种；环进行接种，接种后所形成的菌液圈直径约5～8mm。接种时应先接种含药浓度低的平板，然后接种浓度高的平板，最后接种不含抗菌药物的生长对照平板，以检查整个实验过程中测试菌的存活状态。每个琼脂平板应同时接种标准菌株。
（4）孵育：待接种点菌液干后，平板置37℃孵育16～20h。
（5）观察结果。
3．结果记录及分析。
（1）观察细菌生长情况，完全抑制菌落生长的最低药物浓度为该药对检测菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计。
（2）根据CLSI标准，判定细菌对该抗生素是敏感（S），还是耐药（R），抑或中介（I）。
（三）液体稀释法
1．材料。
菌种：金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、待检菌各1支。
培养基：水解酪蛋白（MH肉汤）。
其他：待测抗菌药物等。
2．方法。
（1）抗菌药物稀释：用MH肉汤稀释抗菌药物原液至待测最高浓度。除每排的第一支试管外，每支试管内加MH肉汤2mL。每排的第1、2管分别加入2mL抗药物稀释液，依次对倍稀释至13管，各管中抗菌药物的终浓度依次为128，64，32，16，8，4，2，1，0．5，0．25，0．12，0．06和0．03μg/mL。另取3支试管，分别标记上“肉汤对照”“测试菌生长对照”和“质控菌生长对照”对照等。
（2）测试菌和质控标准菌的准备：增菌培养同K－B法，生长后的菌液用3～5mL生理盐水校正浓度至0．5麦氏比浊标准，再用MH肉汤1∶10稀释，使含菌量达到107CFU/mL。
（3）用微量加样器取0．1mL稀释菌液由低药物浓度向高药物浓度加于各排试管中，其最终细菌接种量为5×105CFU/mL。加样时加样器吸头必须插到管内液面下加菌并注意避免与管内壁接触。加好菌液后的试管应避免晃动。
（4）37℃孵育16～20h。
（5）观察结果。
3．结果记录及分析。
（1）记录细菌生长情况如表1－9所示。
表1－9 液体稀释法测定菌对××抗生素的MIC
（2）准确判断MIC。
（3）根据CLSI标准，判定细菌对该抗生素是敏感（S），还是耐药（R），抑或中介（I）。
（四）微量稀释法
1．材料。
菌种：金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、待检菌各1支。
培养基：水解酪蛋白（MH肉汤）。
待测抗菌药物抗生素1用于大肠埃希菌512mg/mL，抗生素2用于金黄色葡萄球菌512mg/mL。
2．方法。
（1）稀释抗生素：取无菌EP管11管，编号；每管加200mLMH肉汤；第1管加200mL原液，混匀后吸取200mL至第2管，余次类推；使成2倍稀释系列浓度。
（2）在无菌聚苯乙烯U型微量板上做标记。
（3）用微量加样器在微量板第12孔内加100mLMH肉汤。然后按照从低浓度的顺序从第11孔到第1孔依次加入100mL稀释的药液。
（4）制备菌悬液，用生理盐水将菌液校正到0．5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释1∶100，使含菌量为106CFU/mL。
（5）微量板上从第12孔到第1孔依次每孔加100mL菌液，混匀，加盖并用胶纸密封以减少孵育过程中的蒸发。
（6）置湿盒内于37℃孵育16～20h。
（7）观察结果。
3．结果记录及分析。
（1）记录各实验孔细菌生长情况如表1－10所示。
表1－10 微量液体稀释法测定菌对××抗生素的MIC
（2）准确判断MIC。
（3）根据CLSI标准，分析细菌对该抗生素是敏感（S），还是耐药（R），抑或中介（I），并说明判定依据。
四、思考与讨论
影响药敏结果的因素有哪些？
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