实验六 非发酵菌和其他革兰阴性菌的分离鉴定
一、目的要求
1．掌握铜绿假单胞菌的形态染色、生化反应、培养特性和菌落特征。
2．熟悉不动杆菌属、黄杆菌属的形态染色、生化反应、培养特性和菌落特征。
3．掌握弧菌属细菌形态和培养特性。
二、实验原理
1．G－杆菌简单鉴定流程如图2－3所示。
图2－3 G－杆菌的鉴定流程
2．霍乱弧菌的鉴定流程如图2－4所示。
图2－4 霍乱弧菌的鉴定流程
三、实验内容及方法
（一）铜绿假单胞菌、不动杆菌、黄杆菌的分离培养及形态观察
1．铜绿假单胞菌、不动杆菌、黄杆菌的分离培养。
（1）材料。
菌种：铜绿假单胞菌、不动杆菌、黄杆菌。
培养基：营养琼脂、血平板、SS、Mac。
（2）方法。
分区划线接种，37℃培养箱中培养18～24h，观察平板上菌落特征及色素形成。
（3）结果记录及分析如表2－9所示。
表2－9 其他革兰阴性杆菌的选择培养结果
2．铜绿假单胞菌、不动杆菌、黄杆菌的菌体形态观察。
（1）材料。
菌种：铜绿假单胞菌、不动杆菌、黄杆菌。
试剂：革兰染色试剂。
（2）方法。
挑取典型菌落分别制备涂片，自然干燥后固定，革兰染色，油镜镜检。
（3）结果记录及分析。
观察各菌的染色性、大小、形态、排列等，绘图。
（二）铜绿假单胞菌、不动杆菌、黄杆菌的生化反应
1．氧化酶试验。
（1）材料。
菌种：铜绿假单胞菌、不动杆菌、黄杆菌。
试剂：氧化酶试剂。
（2）方法。
取洁净滤纸片，蘸取少许菌，然后滴加氧化酶试剂，纸片马上变红色为阳性，不变为阴性。
（3）结果记录及分析。
记录各菌氧化酶试验结果。
2．O－F试验。
（1）材料。
菌种：铜绿假单胞菌、大肠埃希菌。
试剂：葡萄糖氧化发酵管。
（2）方法。
取4支O－F管，2支接种铜绿假单胞菌，其中1支加0．5cm液体石蜡为无氧管，另1支不加液体石蜡的为有氧管；2支接种大肠埃希菌，其中1支加0．5cm液体石蜡为无氧管，另1支不加液体石蜡的为有氧管；37℃培养箱中培养24～48h，观察现象，判断并解释结果。
（3）结果记录及分析。
分解葡萄糖则培养基变黄色，不分解葡萄糖不变色。记录实验现象，判断待测菌对葡萄糖的代谢类型。
（三）弧菌属细菌（示教）
1．菌体形态观察。
观察霍乱弧菌的染色示教片，要求绘图。
视频观察霍乱弧菌压滴法的鱼群穿梭现象。
2．分离培养。
霍乱弧菌在碱性蛋白胨水中呈均匀浑浊，有时在液体表面生成稀薄菌膜；在碱性琼脂平板上可形成较大、圆而扁平或稍凸透明或半透明似水滴或淡蓝灰色的菌落，菌落表面光滑或有微细颗粒。因分解蔗糖产酸，在TCBS平板上菌落及其周围呈黄色。因能还原亚碲酸钾，在4号琼脂平板上菌落中心呈褐色。
副溶血性弧菌在TCBS平板上因不发酵蔗糖菌落呈绿色，大小0．5～2mm。
四、思考与讨论
1．一男性病人，43岁，剧烈腹泻水样便伴呕吐1天。无腹痛，无里急后重。查体：疲倦面容，皮肤、唇舌干燥，眼窝内陷。血压80/60mmHg。其感染的病原菌最可能是什么？为什么？写出其详细的检验程序。
2．嗜麦芽窄食单胞菌的生化特点是什么？
3．霍乱弧菌古典型和EL－TOR型有哪些分型实验？
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