实验八 真菌的培养及鉴定
一、目的要求
1．掌握真菌不染色标本的直接检查方法。
2．掌握乳酸酚棉蓝染色的原理和方法；熟悉墨汁负染观察新生隐球菌。
3．熟悉丝状真菌的小培养观察方法。
4．熟悉酵母型真菌的分离鉴定方法。
二、实验原理
临床上将真菌分为引起皮肤和软组织感染的浅部真菌，以及能侵袭深部组织和内脏的侵袭性真菌。从形态结构，真菌分为丝状真菌和酵母型真菌。其中引起浅部感染的多是丝状真菌，而深部感染真菌则多是酵母型真菌和双相型真菌，也有少数丝状真菌（如曲霉菌、毛霉菌，青霉菌、瓶霉菌等）。
丝状真菌菌丝粗壮，在固体培养基上长成颜色不同的绒毛状或棉絮状；繁殖方式也多种多样，具有特殊的繁殖器官。菌丝（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同丝状真菌的重要依据。丝状真菌主要是形态学的鉴定，如不染色标本直接检查、乳酸酚棉蓝染色后检查，小培养观察特征菌丝及特征孢子的动态过程等方法。
酵母型真菌是圆形、卵圆形、不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。念珠菌往往能形成发达的假菌丝。酵母型真菌在形态学基础上还必须进行生化鉴定：有标准鉴定（包括糖同化试验、糖发酵试验、CAFC酚氧化酶试验、尿酶试验、KNO3同化试验、脂肪酸需求试验等）、自动仪器鉴定（如API20C，ID32C等）、显色鉴定。此外，还有血清学玻片凝集试验、动物致病性实验、分子生物学鉴定等。
三、实验内容及方法
（一）真菌的形态结构观察
1．真菌不染色标本的直接检查。
（1）材料。
待测甲屑标本、12%KOH溶液。
（2）方法。
将待测标本置于玻片中央，滴加1～2滴KOH溶液，稍待片刻，盖上盖玻片，将载玻片置火焰上方微微加热，使组织或角质溶解，注意勿烤干或产生气泡。然后轻压盖玻片，驱除气泡并将标本压薄，用棉拭子吸去周围多余液体，避免沾污盖玻片。低倍镜、高倍镜镜检。
（3）结果记录及分析。
镜检观察有无真菌菌丝或孢子，初步报告。
2．乳酸酚棉蓝染色。
（1）材料。
菌株：红色毛癣菌、白假丝酵母菌、新生隐球菌。
主要试剂：乳酸酚棉蓝染色液。
（2）方法。
取洁净载玻片3块，分别滴加1～2滴乳酸酚棉蓝染液，用接种环分别挑取少量菌于染色液中，加上盖玻片（加热或不加热），用低倍镜和高倍镜观察。
（3）结果记录及分析。
观察真菌菌丝或孢子，绘图。
3．新生隐球菌墨汁复染色。
（1）材料。
菌株：新生隐球菌。
主要试剂：墨汁。
（2）方法。
取洁净载玻片1块滴加1滴优质墨汁，然后挑取少量菌与之混匀。按压滴法的制片方法，将一洁净盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片放一滤纸，轻轻按压吸去多余的混合液，注意勿留气泡。用低倍镜和高倍镜观察。
（3）结果记录及分析。
新生隐球菌为圆形或卵圆形酵母细胞，有芽生孢子，细胞外有一层胶质样荚膜，一般厚度与菌体相等。菌体和荚膜不着色，透亮，背景为黑色。
观察待检菌，绘图。
（二）真菌的培养及鉴定
1．丝状菌的分离培养及初步鉴定。
（1）材料。
菌株：红色毛癣菌。
培养基：马铃薯葡萄糖琼脂。
（2）方法。
大培养：用接种针挑取少量待检菌，接种于培养基上，28℃培养箱中培养7d，每日观察生长情况和菌落特征。
小培养：马铃薯葡萄糖琼脂倾注至无菌平皿使成很薄的一层，用解剖刀将培养基切成1cm2大小，挑取一小块置于无菌载玻片上；接种针挑取适量菌，接种至载玻片上的琼脂块的四周侧面，盖上盖玻片；将接好菌的载玻片放入一无菌平皿中，同时放置若干吸满灭菌水的无菌棉球，盖上皿盖，28℃培养箱中培养7d；每日镜检观察菌丝、孢子生成情况，根据丝状真菌的菌丝孢子进行初步鉴定。
（3）结果记录及分析。
大培养：记录菌落大小、形态、颜色（正面和反面）、质地（边缘和中间）。绘图或拍照。
小培养：每日记录绘图或拍照菌丝、孢子生成情况，参考真菌鉴定手册，根据丝状真菌的菌丝孢子进行初步鉴定。
2．酵母型真菌的培养。
（1）材料。
菌株：白念珠菌、近平滑念珠菌。
培养基：科玛嘉培养基、沙氏培养基。
（2）方法。
少量待检菌，分别接种于科玛嘉培养基、沙氏培养基上，37℃培养箱中培养24～48h，观察菌落特征。
（3）结果记录及分析。
酵母型真菌在沙氏培养基上形成灰白色或奶酪色菌落，表面湿润光滑、边缘整齐。
科玛嘉念珠菌显色平板上，不同的念珠菌可形成不同颜色的菌落如图2－6所示，可初步鉴定。记录待检菌的生长情况并加以初步鉴定。
3．芽管形成试验。
（1）材料。
菌株：白念珠菌、近平滑念珠菌。
培养基：小牛血清。
图2－6 不同念珠菌在科玛嘉培养基上的生长状况
（2）方法。
取无菌小试管2支，加入0．2mL小牛血清，分别接种少量的待检菌，充分震荡混匀后，37℃孵育；每隔1h用接种环取出含菌血清置于载玻片上，加盖玻片，用低倍镜和高倍镜观察，共检查3次。
（3）结果记录及分析。
观察待检菌是否有芽管形成，出现芽管的大致时间，并绘图。
4．酵母型真菌的数码鉴定（示教）。
（1）材料。
待测菌、酵母型真菌生化鉴定微量管。
（2）方法。
参考“肠杆菌科未知菌的数字编码鉴定”，详见说明书。
（3）结果记录及分析。
参考“肠杆菌科未知菌的数字编码鉴定”。
四、思考与讨论
1．试述浅部真菌的菌落及镜下形态。
2．阐述双相真菌的特点。
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