一、呼吸道标本中常见的病原体
痰液标本的细菌学检验有助于下呼吸道感染性疾病的诊断,而以链球菌、白喉棒状杆菌等感染为主的上呼吸道感染则以鼻咽拭子为检材。
痰液标本可能出现的细菌常见的有:A族链球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、黏质沙雷菌、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、白喉棒状杆菌、结核分枝杆菌、炭疽杆菌、嗜肺军团菌、念珠菌、曲霉菌等。
上呼吸道有大量的正常菌群存在,正常情况下这些细菌并不致病,但在机体抵抗力下降或某些外在因素作用下,可以侵入下呼吸道致病。因此要正确评价这些菌群的致病作用并不容易。特别是在抗生素作用下或在大量正常菌群掩盖下,致病菌难以检出。
二、呼吸道标本一般细菌检验程序
呼吸道标本一般细菌检验程序如图3-5所示。
图3-5 鼻咽拭子一般细菌检验程序
痰液标本的一般细菌检验程序如图3-6所示。
图3-6 痰液标本的一般细菌检验程序
三、注意事项
1.上呼吸道标本要及时送检,防止干燥。采集时要尽量避免正常菌群的污染。下呼吸道标本为痰液,选取脓血性的痰液用于细菌学检验。
2.鼻咽拭子检查脑膜炎奈瑟菌通常用于带菌者的检查,采集的标本要保温35℃,防止干燥。最好床边接种,必要时使用卵黄双抗运送液。
3.挑选痰液中脓、血性部分涂片,干燥固定后,进行革兰染色镜检。如发现形态典型、有特殊结构,初步可以确定所属菌属或种的细菌,可直接报告。如查见革兰阳性葡萄状排列的球菌,可报告“痰液涂片查见革兰阳性球菌,形似葡萄球菌”,查见革兰阳性双球菌、矛头状,有明显荚膜时,可报告“痰液涂片查见革兰阳性双球菌,形似肺炎链球菌”。如果不能直接确定菌属或种的细菌,可报告“痰液涂片查见革兰×性×菌”。如低倍镜视野白细胞小于10个,上皮细胞大于25个,则应视为不合格标本,不宜做培养,建议重留。
4.痰液标本找抗酸杆菌。
用接种环取干酪样或脓性部分痰液标本制成涂片,自然干燥后固定,进行抗酸染色,或集菌涂片后涂片抗酸染色。
离心沉淀集菌法:在标本中加入等量2%NaOH,消化痰液。然后置高压蒸气灭菌器103.43kPa灭菌后,3000r/min离心30min,取沉淀涂片,进行抗酸染色。
漂浮集菌法:将2~3mL标本消化灭菌后,加入1mL的二甲苯或汽油,塞紧瓶口,240次/分震荡10min,加蒸馏水至瓶口,静置30min,取液体和油层间的油沫涂片,干后进行抗酸染色。
5.分离培养。
痰液标本在接种前,应进行前处理:
均质化法:向痰液标本内加入等量的pH值为7.6的1%胰酶溶液,放置35℃、90min使痰液均质化,降低痰液的黏度,方便取材和均匀接种。
洗涤法:取无菌平皿4个,各加入无菌生理盐水10~20mL,将痰液标本放入第1个平皿中,用接种环用力震摇,将脓痰分散为小块悬浮于盐水内,将小块脓痰取出依次放入第2、3、4个平皿中重复以上操作。最后在第4个子皿收集脓痰小块,接种于平皿。同时接种未经洗涤的痰液标本,作为对照。
6.特殊细菌培养。
为了检出特定的致病菌,可以使用选择性培养基,如使用双抗平板选择脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌选择性平板等,可以提高检出效率。
(1)结核分枝杆菌培养:将痰液标本进行前处理后的悬液,用无菌吸管加2~3滴于罗-琴培养基或7H-10液体培养基中,35℃孵育至8周,每周观察1次。如有淡黄色、干燥、表面不平的菌落生长,则进行涂片抗酸染色,如为抗酸杆菌,结合菌落形态、生长时间、色泽及鉴定试验,可报告“结核分枝杆菌生长”,也可结合菌落数量和生长时间进行报告。8周后未生长者报告“经8周培养无结核分枝杆菌生长”。
(2)嗜肺军团菌培养:取气管分泌物接种于活性炭酵母琼脂(CYE)或费-高(FG)平板,35~37℃、5%CO2培养,每天用肉眼和显微镜观察,直至第14天。如有小的、灰白色菌落生长,在F-G上的菌落,360nm下可见黄色荧光。取已生长的菌落做涂片革兰染色,为不易着色的革兰阴性多形性杆菌,可用嗜肺军团菌的直接荧光抗体染色进行鉴定。
四、病例分析
1.患者,男,12岁,因肺部感染,出现咳痰、发热、喘息、呼吸急促而入院。检查发现患者支气管扩张,肺膨胀不全并伴肺部纤维化,取痰液进行细菌培养发现在肺部有革兰阴性杆菌,在血平板上长成扁平,湿润的灰绿色菌落,周围有透明的溶血环,该菌氧化酶阳性,有动力,能产生带荧光的水溶性色素。
(1)以上症状提示最可能的病原菌是?
(2)为进一步确诊,应首先做什么检查?
2.患者,男,82岁,有心血管系统症状,出现心悸,气急,双肺呼吸音粗,他还有消化性溃疡,季节性疼痛、多有腹痛、腹胀、恶心呕吐,泛酸嗳气等不适,取痰液进行过夜细菌培养,在血平板上的产生金黄色的菌落,在菌落周围有明显的透明溶血环,血浆凝固酶和触酶均阳性。
(1)以上症状提示最可能的病原菌是?
(2)采用哪种方法能进行快速诊断?
3.患者,女,25岁,因咽喉痛、扁桃体二度肿大、充血、头痛、寒战、干咳和发热,已持续6天。近期不间断地咳痰,并伴有无胸膜胸痛。胸部有啰音,X胸透显示支气管肺炎浸润但无实变。痰液培养2天后可见细菌生长,在血平板上形成灰色扁平,中间凹陷的菌落,周围有草绿色溶血环。该菌为革兰阳性球菌。
(1)以上症状提示最可能的病原菌是?
(2)采用哪种方法能进行快速诊断?
4.患者,男,6岁,因咳痰并伴蛋白尿8天、咽喉痛、鼻塞等症状而入院,取痰液进行细菌培养过夜,在血平板上可见菌体较大,灰白色呈黏液型,相邻菌落容易发生融合,用接种环挑取时呈长丝状。革兰染色为革兰阴性球杆状,成双排列。
(1)以上症状提示最可能的病原菌是?
(2)采用哪种方法能进行快速诊断?
5.患者,女,7岁。发热、声音嘶哑、喉痛伴咳嗽4天,急诊入院,体温38℃,面色苍白,唇稍紫,咽后壁、腭弓和腭垂等处发现白色膜状物,心律不齐,灰白色膜状物涂片有异染颗粒。
(1)以上症状提示最可能的病原菌是?
(2)采用哪种方法能进行快速诊断?
6.患者,男,55岁,患有肺气肿,因急性肺部剧烈疼痛、干咳、高热和水泻而入院。病人严重嗜睡和不间断地咳出黏液性脓痰,X线胸片显示单侧肺炎,肺下叶呈模糊状阴影,在痰液中亦发现含有嗜中性白细胞,用革兰染色法镜检,未发现病菌,气管引流物在普通血平板和巧克力平板培养未见细菌生长,但在富含L-半胱氨酸的活性炭-酵母浸出液琼脂培养基上培养4天后长出菌落,呈蓝绿色,含有革兰阴性短杆菌。
(1)最可能的病原菌是?
(2)根据该菌的特点写出详细的检验程序?
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