组织工程与组织器官缺损修复

第一节　组织工程与组织器官缺损修复

一、组织工程研究

创伤、肿瘤等原因造成的组织、器官缺损和功能障碍是危害人类健康的重要原因，而缺损组织、器官的修复和功能重建也是目前临床外科面临的主要难题。大面积的缺损通常都需要采用自体或异体组织、器官移植进行修复，自体移植存在着“以创伤修复创伤”的遗憾，而异体移植中供体来源不足、免疫排斥是主要的缺陷。组织工程学（tissue engineering,TE）的提出、建立和发展，为解决这一难题提供了新的途径。它的基本原理是将少量种子细胞经体外扩增后与生物材料复合，构建出新的组织或器官，用于替代和修复病变、缺损的组织器官，重建生理功能。组织工程学是指利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官及组织的技术（由美国国家科学基金委员会在1987年提出）。

再生医学（regenerative medicine,RM）有着悠久的历史，原先指体内组织再生的理论、技术和外科操作。现在，其内涵已不断扩大，包括组织工程、细胞和细胞因子治疗、基因治疗。组织工程学是20世纪80年代后期提出的一个新概念，它是以细胞生物学和材料工程学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的一门新型学科。组织工程学是一门新兴的边缘学科，是生物学、细胞学、材料学、医学等学科相结合的产物，是再生医学目前研究的热点方向。虽然组织工程学诞生于20世纪80年代，但它的发展却非常迅速，尤其是皮肤、软骨等组织的研究，目前已商品化并应用于临床。简单地讲，组织工程学是指通过应用工程学和生命科学的原理，产生有生命力的活体组织或器官，并将其用于对病损组织或器官进行结构、形态和功能的重建甚至永久替代的学科。它的主要任务是实现受损组织或器官的修复和重建，延长寿命和提高健康水平。RM的几个方面中，利用组织工程学原理修复和再生受损组织或器官具有以下几个优点：首先，组织工程学只利用少量的组织或器官，便可扩增出大块的组织或完整的器官，可达到完全修复；其次，组织工程学修复损伤是利用与受区有相同功能的细胞经扩增后形成活的组织或器官来修复，具有与原器官相同的结构及功能，能够达到功能修复；最后，在修复过程中，可利用生物工程原理对组织或器官进行塑型，使它与原组织或器官相符，达到形态重建。由此可见，组织工程学是再生医学的外延，拓宽了再生医学的广度和深度。将传统组织修复与生物工程相结合，具有很大的潜力，并已成为再生医学研究和发展的主要方向。国际再生医学基金会（International Foundation Regenerative Medicine,IFRM）明确把组织工程定为再生医学的分支学科，但很多情况下，两者常混用。

组织工程被认为是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上又一新的里程碑，也是一场意义深远的医学革命。组织工程最初是用来描述组织体外构建的有关理论和技术。现在，其内涵也在不断扩大，凡是能引导组织再生的各种方法和技术均被列入到组织工程。

第一位提出“组织工程学”术语的是美籍华裔学者冯元祯教授。1987年美国国家科学基金会根据冯教授的建议，正式采用“组织工程学”这一术语来描述这一新兴的领域并正式建立了这门新学科。基于组织工程的基本原理，科研人员通常从机体获取少量活组织，并将功能细胞（种子细胞）从组织中分离出来并在体外进行培养、扩增后与可降解、吸收的三维支架材料按一定比例混合，植入体内病损部位，生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内增殖和分泌细胞外基质，最后形成所需的组织或器官以达到创伤修复和功能重建的目的。以往强调，要有种子细胞和生物材料两者同时介入以进行组织构建和再生才算是组织工程。现在不少学者提出仅用生长因子或转基因载体与生物材料复合就可达到组织工程化构建的目的，故也属组织工程。

从外科学的发展历程来看，先后经历了三个“R”阶段，即切除（recection）、修补（repair）和替代（replacement）。组织工程学的出现，意味着外科学已进入“再生医学（regenerative medicine）”的新阶段，是第4个“R”。

二、组织工程研究面临的问题

（一）种子细胞

1.自体细胞可来自自体组织，分离培养功能细胞；也可由骨髓培养的间充质干细胞，再定向诱导分化为所需的功能细胞。其优点很多，但操作费时，需经过分离、培养、扩增、鉴定，并与人工细胞外基质联合培养一段时间才能植入人体，因此对急症手术的组织修复或恶性肿瘤切除后修复不适用。老年人自体细胞的增生能力差，形成新组织相对较少。研究自体细胞简易培养、扩增技术，使其能在短时间内获得足够数量和功能很强的种子细胞，并能降低成本，则临床应用价值会更大。

2.同种异体细胞经基因改造，建立无致瘤倾向的标准细胞系才能进行产业化生产。胚胎来源的同种异体细胞优于成体细胞，但需降低其抗原性（如应用免疫隔离技术等）。要保证临床应用的安全性，其致瘤性、遗传物质的改变等应作出长期评价。目前尚无经过基因改造的细胞用于组织工程临床。

3.胚胎干细胞（ESC）要研究胚胎干细胞形成组织的微环境及条件；胚胎干细胞定向分化功能细胞的条件及调控；胚胎干细胞成组织的功能状态及最后结局；应用胚胎干细胞的社会伦理等。

4.异种细胞目前研究较多的是猪，必须解决排斥反应问题。

（二）细胞培养技术

1.快速扩增细胞的形态、功能检测?要确认经快速扩增后仍能保持原代细胞的形态和功能时，才能用于构建组织工程产品。

2.生长因子应用生长因子在体内的促增殖、促分化作用是由自身调节机制控制；在体外如何调控，生长因子作用后细胞遗传物质是否会发生改变，临床应用给药途径及安全性等问题，都需进一步探讨。

3.细胞生长与应力的关系细胞在体外培养条件下，失去体内的力学环境，其形态、功能均会受到影响。对于什么样的应力，多大量的应力，应力作用的持续时间和方式，应力作用下细胞的改变等均需作深入研究。

（三）生物活性材料

生物材料促进组织愈合与再生的研究已有很长的历史，近10年来发现了很多具有引导或诱导组织再生的材料。Chester和Anthony（2004）将组织工程材料分为3类：天然衍生材料，如胶原、几丁质等；脱细胞基质，如脱细胞膀胱黏膜下层、小肠黏膜下层、脱细胞骨等；合成高分子材料（syntheses polymer materials），如PLA、PGA、PLGA等。理想的生物支架材料应具备以下特点：

（1）生物相容性好。

（2）可降解，其降解产物对人体无害。

（3）有一定力学强度。

（4）可塑形。

（5）材料降解速度与细胞的功能发挥尽可能相匹配。

（6）材料本身具有引导或诱导组织再生的能力。目前，所有支架均不完全具备上述要求，因此不仅要研究单一成分材料，更要研究复合材料及生物衍生材料，经去脂、去细胞、去抗原处理后，可能成为较好的细胞外基质用于临床。

（四）细胞与支架材料的相互作用

细胞停泊在支架材料上，不仅是一种物理行为，而且还可能有生物化学、分子生物学、遗传性状的改变。细胞与支架材料的相互作用研究较少涉及分子水平、蛋白质水平、基因水平的研究，而这正是临床应用安全性需要阐明的基础理论。

（五）临床验证研究

基于临床前研究结果，向国家药监部门提交相应临床试验设计申报材料，经相关部门批准，同时获得相关伦理委员会批准，并得到病人知情许可后方可进行临床试验。通过临床试验，对相应生物工程制品的安全性（局部组织反应和全身反应）、组织的愈合再生能力、修复组织的功能状态、在人体内细胞与支架的结合、修复组织的远期结果等进行评估后，决定该产品是否进入临床Ⅲ和Ⅳ长期安全性有效评估，或对组织工程产品进行完善后重新提交临床试验方案进行临床试验。

三、细胞治疗

从胚胎或成人组织（器官）分离培养功能细胞在技术上已经十分成熟，制约临床应用的主要因素是大规模扩增技术，现已基本得到解决。如从患者活检得到的皮肤或从包皮切除术中得到的皮肤分离培养成纤维细胞和表皮细胞，均可达到相当大的扩增量，已经可在体外培养成为单层表皮层用于皮肤的修复。Grande（1989）首先用兔的自体关节软骨细胞移植修复关节软骨缺损，组织学观察证明有82%的软骨修复。1997年美国FDA批准用于临床。通过关节镜技术操作，创伤小，并发症少。随访观察发现74%为透明软骨，组织学显示了接近正常的关节软骨结构，可用于15cm²全层软骨缺损的修复。

干细胞（stemcell）是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可通过分裂维持自身细胞的特性和大小，又可进一步分化为各种组织细胞，从而构成各种复杂的组织器官。干细胞是组织再生的源泉和基础，是再生医学研究的前提。采用干细胞移植可直接再生组织和器官：①用干细胞携带治疗基因，经过诱导分化为成体细胞；②利用细胞转化的特性，可用干细胞进行自体组织和器官的修复；③干细胞作为种子细胞，还可与降解支架材料联合培养，在体外构建组织或器官。干细胞主要包括胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（adult stem cell，ASC）。胚胎干细胞是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团的细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型，所以又被称为全能干细胞，这使胚胎干细胞成为组织工程学中最好的种子细胞的条件，但对胚胎干细胞的研究以及应用都涉及社会伦理学的问题，目前尚未解决，一些国家甚至明令禁止对胚胎干细胞的研究。因此，对胚胎干细胞应用做进一步的研究首先要解决伦理学的问题，相信胚胎干细胞应用于组织工程学相对于它所涉及的伦理问题，肯定是利大于弊的。成体干细胞是指存在于已分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。现已证明成体干细胞普遍存在于机体的各种组织器官中，在体内特定的微环境中，大多处于体眠状态，在病理状态或在外因诱导下可表现出不同程度的再生和更新能力，当组织受损时，微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。利用这一原理，我们可在体外培养时，通过改变微环境中的生长因子以及其他因素，来定向诱导干细胞的分化。比如骨髓间充质干细胞、表皮干细胞、脂肪干细胞、胰腺来源的干细胞等均在组织修复及再生中发挥重要作用。远隔损伤处的干细胞经动员后出现“归巢”（homing）而至损伤区参与修复过程。

尽管干细胞在细胞治疗、组织器官修复、发育生物学、药物学等领域有着广阔的应用前景，但仍存在许多问题，主要有以下几点：

（1）维持SC未分化状态的机制。

（2）干细胞定向诱导分化的调控机制。

（3）获得高数量和高浓度的分化细胞，为组织工程提供种子细胞。

（4）是否具有形成复杂器官的能力。

（5）用干细胞作替代治疗的移植排斥问题。

（6）临床应用的安全性。

（7）可塑性机制。

（8）“归巢”（homing,游离干细胞定向迁移过程）的调控机制。

（9）相关的伦理和社会学问题等均有待深入研究。

四、展望

在近几年的研究及临床实践中，已经证明干细胞、组织工程植入物在组织器官的愈合、再生中发挥了重要作用。虽然有些科学问题尚待阐明，有些技术难题尚待攻克，但其发展趋势必然会为病损组织器官的愈合、再生创造出更多、更新、更实用的治疗方法，在挽救患者生命、减少伤残及最大限度地恢复功能方面发挥巨大作用。因此有人预言，组织工程的出现是“一场意义深远的医学革命”；对成体干细胞可塑性的认识及人胚胎干细胞的建系及定向分化，为细胞治疗奠定了基础，使医学研究进入了“再生医学的新时代”。但是构建不同的具有正常生理功能的器官，特别是重要的生命器官，难度非常大，甚至是否具有形成复杂器官的能力，目前还不清楚，所谓“生物科学人体时代”的到来，还言之过早。在今后相当长的时间内，再生医学（组织工程）将和替代外科平行发展，相互补充。再生医学的发展还面临着伦理学问题，哪些是可以突破的？哪些是不应突破的？这些都有待我们在前进中逐步解决。