乳腺癌-的检测

第一节　乳腺癌Her-2的检测

Her-2为人表皮生长因子受体-2，是乳腺癌预后不良的重要独立因素。研究表明，24%～30%的乳腺癌组织中存在Her-2受体过度表达，其过度表达导致肿瘤细胞异常增殖、侵袭性和转移危险增加。因此Her-2可以作为分子靶向治疗的重要靶点。目前已经开发出多种针对Her-2的靶向治疗药物。所以针对Her-2的检测也是乳腺癌治疗中的关键环节。

■一、乳腺癌Her-2的诊断

目前经FDA批准，乳腺癌细胞Her-2的检测方法仅有两种：免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）法测定Her-2蛋白过表达；荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization，FISH）法定量检测Her-2基因扩增，后者一直被认为是Her-2诊断的金标准。另外，一种新的检测Her-2过度表达的方法，色素原位杂交法（Chromogenic and Fluorescence in situ Hybridization，CISH）也得到了一定的认识和应用，并且显示与标准IHC法和FISH法结果有较高的一致性。

IHC是一种广泛应用的检测方法，它是通过特异性抗体检测细胞内及细胞表面的蛋白，FISH和CISH是在近几年开始被应用的检测方法，它们是一种在组织切片、细胞涂片及染色体制片上对核酸进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法，具有灵敏、特异、直观等优点。

（一）IHC法

IHC的实验流程主要是以下几个步骤：封闭、滴加抗体、显色三大步骤。一般的病理实验室均有条件进行操作（表9－1）。

表9-1　IHC的判定标准

以FISH结果作为参比标准的话，针对IHC的准确性和敏感性，不同的实验室得出了相似的结论：IHC结果为3+时，FISH阳性率为91.7%；IHC结果为2+时，FISH阳性率为23.3%；IHC结果为1+和0时，FISH阳性率分别为7.4%和4.1%。

以上结果显示IHC法在结果为1+和0时，使用FISH方法有一定的阳性率，但是p<0. 001，这表明FISH和IHC的一致性仍然是很好的，如果IHC结果为0或者1+，可以酌情应用FISH作检测；当IHC结果为2+时，一致性为23%～25%，这时需要应用FISH法进行进一步的检测；3+的样本中准确率与FISH方法的一致性较高，可以直接作为诊断依据。

（二）FISH法

更多的科研工作者和检验人员倾向于使用FDA认证的Abbott-Vysis—PathVysion进行Her-2基因的检测。

这一技术在以下几个方面体现出了它的优势：实验流程操作简单（PathVysion试剂盒属于直接标记的探针，杂交后可以直接在荧光显微镜下观察结果）；能够检测出微量的Her-2基因扩增；在检测冰冻样本和石蜡样本时显示出了同等的精确度。

Abbott-Vysis提供的FISH Her-2检测试剂包括两种，针对Her-2的单色探针和包含Her-2、17号染色体的双色探针（PathVysion/Vysis），后者能够明确区分Her-2基因的单纯扩增和非整倍染色体。这对于明确诊断乳腺癌有重要的意义。图9-1-1显示的是应用FISH和IHC两种检测方法得出的结果。

图9-1-1　乳腺癌FISH和IHC检测结果对照

（三）C ISH法

CISH（色素原位杂交法，Chromogenic and Fluorescence in situ Hybridization）作为一种新的检测Her-2过度表达的方法逐步得到应用，它的原理是首先将癌基因探针用地高辛或生物素标记，利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的反应使实验者在光学显微镜下检测福尔马林固定的石蜡包埋的组织、染色体中期分裂和固定的细胞。CISH的操作流程和FISH相似，先要进行杂交前预处理（蛋白酶消化等），然后进行杂交反应（滴加杂交液，变性，孵育杂交）、最后一步杂交后处理（洗涤封闭，免疫组化信号放大、显色）相对FISH法要繁琐一些。

它的主要优点是:可以以组织切片的方式储藏；能做组织学评价；用普通光学显微镜进行结果观察。研究发现，在使用FDA认证的PathVysion检测结果作为为金标准时，CISH和FISH在IHC为3+时有较高的一致性；IHC为2+时CISH的敏感度与FISH相比有了一定的差异；IHC为1+和0+时CISH与FISH的差异更为明显。总体来说，CISH的正确率为93.8%，阳性预测值为91.7%，阴性预测值为95.8%。

表9-2　CISH和FISH、IHC表达

数据如表所示（表9-2）：在2+、1+和0中，共有10个样本（6.4%）CISH没有检测出扩增。提示了当基因扩增为低水平，即每个细胞中的扩增数目在6～10时，CISH方法没有FISH敏感，会产生一定的假阴性结果。

对于大多数样本来说，如果CISH检测结果是很明确的阴性或者阳性时，则不需要对染色体进行检查。但是由于CISH无法检测非整倍染色体，对于因此产生的假阴性，各个实验室要根据自己实验条件设定一定的阈值，来减少非整倍染色体存在造成的误差。另外，由于CISH法仍然是利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的反应进行结果的检测，其结果不可避免的显示为典型的酶学“阳性簇”，阳性信号无法准确计数。

IHC、FISH和CISH这三种方法各有利弊，在选择最合适的方法进行乳腺癌诊断时，应针对三种方法的不同特点进行选择。

IHC法阴性结果的诊断准确率是很高的，如果样本是0/1+，那么可以根据患者实际情况判定是否需要进行进一步的检测。如果结果为3+，那么一般认为是Her-2阳性，可以按照NCCN指南进行治疗。对于检测结果为2+的样本，则需要进行基因水平的检测。

FISH法结果准确，大多数欧美病理检测中心以此为标准，尤其是使用FDA认证的Abbott-Vysis—PathVysion试剂盒判定的检测结果。FISH法在低倍、高倍扩增及非整倍染色体检测中都显示了极高的灵敏度和准确性，同时FISH法对于判定冰冻切片样本和石蜡切片样本时有同等的准确性，开阔了样本的适用范围。对于价格问题，选择合适的检测形式，整体的诊断费用是可以作为必备的检测方法接收的。

CISH法操作与FISH有一定的相似之处，与FISH有较好的一致性：正确率为93.8%，阳性预测值为91.7%，阴性预测值为95.8%。应该注意的是CISH对于低倍扩增（6～10个扩增/cell）检测的灵敏度明显下降，对于有非整倍体染色体的样本，同样会有假阴性的检测结果。检测结果为酶学“阳性簇”，阳性信号无法准确计数。基于以上原因不建议使用CISH作为IHC结果为0/1+/2+样本Her-2阳性确诊的方法，在这种情况下我们建议使用FISH方法检测结果作为确诊依据（图9-1-2）。

图9-1-2　乳腺癌标本Her-2检测流程