灵敏的特异性检测

5灵敏的特异性检测

特异性是免疫反应的基本特征，就像一把钥匙开一把锁一样，即一种抗体或一个克隆的致敏淋巴细胞仅对刺激它们产生的抗原发生反应，而不对其他抗原有影响。这种特异性非常高，以至于可以区分非常微小的差异，如同样是氨基苯甲酸，由于酸基位置的不同（邻位、间位或对位），特异性也随之改变，即针对间位氨基苯甲酸的抗体不能与同位或邻位氨基苯甲酸结合。这就保证了机体的免疫系统能够特异地区别任何两种抗原物质。在19世纪和20世纪交替前后的10年中（1894—1903年），早期的细菌学家已发现了细菌与相应抗体相互作用的现象，如凝集反应、沉淀反应、溶菌反应等；肥达（Widal，1896）将凝集反应用于临床辅助诊断伤寒或副伤寒，以其姓氏命名的肥达反应沿用至今。由于反应中所用抗体，多取自血清，因此研究抗原和抗体在体外的各种免疫反应现象的科学称为“血清学”。此阶段人们利用这些免疫反应主要检测各种病原体感染，给临床诊断和治疗提供依据。在长期的实践中，人们还创造和衍生出各种各样的其他免疫学检测方法，以适用不同的检测目的。

20世纪40～70年代，由于免疫标记技术和单克隆抗体的出现，使得免疫学检测手段有了新的突破。所谓免疫标记技术就是指用荧光素、酶、放射性同位素、生物素—亲和素或电子致密物质等标记抗体或抗原所进行的抗原抗体反应。此技术不但特异性增强，而且大大提高了其敏感度，如单纯疱疹病毒抗体用酶标法测定比微量补体结合试验敏感200倍以上。用免疫标记技术可检测出皮克级（相当10¹²克）含量极其微小的物质，很多过去传统血清学方法测不出的情况都可用这些方法进行，从而使得检测体内含量极其微小的激素和其他物质成为可能。此外，这些方法不但可以定性和定量，甚至可以定位，因此对一些疾病的发病机制提供了有力的佐证，例如可在细胞和亚细胞水平上观察和鉴定待测物质，并可分析它们与疾病的关系。目前，这些方法已被广泛用于：①传染病诊断与监测：如检测细菌、病毒、寄生虫等病原体，或抗体测定，如测定抗病毒抗体、抗寄生虫抗体等。②自身免疫病诊断与监测：检测各种自身抗体，如检查抗核抗体的动态升降，可辅助诊断全身性红斑狼疮，并判断其病情活动状况及疗效。③肿瘤诊断：如检测甲胎蛋白，辅助诊断肝癌。④其他：在内分泌学方面用于检测各种激素水平；在血液学方面，检测第VIII凝血因子、补体成分等；在卫生学方面，用于监测食品卫生，如检测食品中沙门菌、各种毒素等。

随着分子生物学技术的发展，1985年人们创建了一种奇迹般的体外扩增特异DNA片段技术-聚合酶链反应（PCR）技术，又称“体外基因扩增”、“无细胞分子克隆”，它可在短短的几个小时内将皮克水平DNA中特定序列的单个拷贝扩增上百万倍。用PCR技术可将极微量的外源性基因序列（如细菌、病毒、寄生虫等）大量扩增，从而使检测灵敏度大大提高，超过血清学检查、原位杂交和许多其他方法，具有准确、快速、取材量少等特点，特别适于大量标本的筛选及流行病学的调查。目前PCR技术已用于多种传染性病原体的检测，如乙肝病毒、风疹病毒、巨细胞病毒、结核杆菌等。在癌症的诊断中使用该技术，可在10⁵个正常细胞中检出一个肿瘤细胞，从而使癌症的早期诊断及预后判断成为可能。此外，用PCR技术可从任何极少量样品（如毛发、唾液、精液、血斑等）中扩增特定的DNA遗传标志，从而成为一个极其可靠的追踪犯罪分子和亲子鉴定的证据。1992年Sano等将抗原抗体反应与PCR技术结合在一起，建立了一种新的检测微量抗原的技术，这种技术被称为免疫PCR，它具有非常高的敏感性，比上述酶标记技术敏感10⁵倍，在理论上可以检测到一个分子的抗原，由于该技术是基于抗原抗体免疫反应，从而又保证了检测的特异性。免疫PCR的原理（图3-2）就是将抗原吸附于固相，先让其与生物素标记的特异性抗体结合，再利用亲和素和生物素具有高亲和力的特点，让亲和素在生物素标记的抗体和生物素标记的DNA之间起连接作用，即只有同抗原结合的抗体才能通过亲和素—生物素系统进一步结合DNA，经PCR扩增系统将结合DNA放大，并用电泳检测放大产物，经与标准抗原制备的标准曲线比较，可准确得出待测抗原的实际含量。这是一个新近发展的免疫检测技术，也是免疫检测方法中最敏感的一种，特别适用于检测一些含量极少的抗原分子，故具有非常广泛的应用前景。

图3-2　免疫PCR原理示意图

由于高新技术的出现，如基因工程、蛋白工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等的出现使免疫学从理论和技术得到了飞速发展，自20世纪70年代以来免疫学已出现两个发展高峰，第一个高峰是对免疫细胞的研究和单克隆抗体的制备；第二个高峰阐明了长期以来令免疫学家困惑不解的抗体多样性的起源问题，发现了许多重要的细胞因子及其受体和160多种与细胞分化有关的表面分子，被统称为分化群（CD）。如果说20世纪70年代以来是从细胞水平来阐述免疫应答的话，那么20世纪80年代以来的第二个高峰，就将免疫学研究引入分子水平，使我们在不久的将来能用分子语言描述免疫系统的功能，解决免疫系统异常引起的各种疾病。高新技术推动了免疫学的发展，而免疫学的发展，又建立了许多用于防御的现代化武器，这将有力地保护人类同各种疾病作斗争。让我们珍惜这个黄金时代，学习和掌握生物高新技术，共同塑造世界的未来。今天使用生物高新技术出色的人，将是下世纪最成功的人！