治标又治本的“分子疗法”

3治标又治本的“分子疗法”——基因疗法前景灿烂

1990年世界上第一例基因治疗实施。全世界的有关专家将关切的目光投向一位9岁的小女孩身上，她得的是重症联合免疫缺陷病（SCID），必须进行基因治疗，否则，任何轻度的细菌或病毒感染都将夺去她的生命。这种病是由于造血干细胞分化缺陷而引起淋巴细胞的免疫功能缺陷。出生6个月起发病。为了防止感染，这位小女孩平时只能与外界隔离，生活在空气、物品、食物都经过消毒的无菌室中。究其病因，是由于体内缺乏一种ADA酶（腺苷脱氨酶）所致。约有20%的SCID是ADA酶缺陷引起的。该酶缺乏，将导致脱氧腺苷和脱氧二磷酸腺苷不能脱氨而堆积在细胞内，特别是淋巴细胞内，阻碍DNA正常合成，产生毒性效应。实际上，ADA酶是由ADA基因编码和产生的；小女孩体内ADA酶的缺乏，是ADA基因发生突变的结果。这次对她进行基因治疗的目的是将外源的、正常的ADA基因导入她的淋巴细胞内进行补偿。治疗后，患孩血液中ADA酶水平逐渐升高，说明导入的外源ADA基因已经正常工作。10个月后，ADA酶活性达到正常值的25%，显示出基因疗法的明显效果。人们从这次成功中，得到了极大的鼓舞。

到底什么是基因疗法？它和传统的治疗途径有何区别呢？基因疗法是在基因水平上进行的带有根本性的治疗方法。我们已经知道，遗传性疾病是由基因突变引起的。因而，经典的基因疗法是指基因置换或基因纠正，即切除或灭活内源遗传缺陷基因，在原位插入具有正常功能的外源基因来代替它。但是导入的外源基因要做到“原位插入”，相当困难，往往只能“随机插入”到染色体的任意部位，以补偿相应内源基因的缺陷而获得治疗效果。如前面我们所说的缺乏ADA酶基因的小女孩，医生就可以将外源性正常的ADA基因转入到她的淋巴细胞中去，利用外来基因产生的ADA酶来弥补该基因内源性的缺陷。又如，由于贵族之间的近亲通婚，中世纪北欧国家王室中流行的遗传病——血友病，是因为缺乏凝血因子Ⅷ所致，现在可以通过导入相应的正常编码Ⅷ因子的基因而得到治疗。随后，人们又了解到除了遗传病外，许多后天获得的疾病，如肿瘤，它们的发生和发展也都与细胞内癌基因的突变有关，故现代基因疗法的概念有所扩展，除了基因置换、纠正外还包括基因补偿和基因添加，也即为了达到治疗目的，还可以导入一些原来细胞内不表达的基因。例如把多重耐药性（MDR）基因导入正常细胞，这样在对癌症患者进行化疗时，可保护有了耐药功能的正常细胞免受化疗药的破坏。又如将所谓的“自杀基因”或“抑癌基因”导入肿瘤细胞，利用它们制造的酶或蛋白来杀伤或抑制癌细胞。此时，这些外源基因的产物就起着类似“基因药物”的作用；还有一类称“反义基因”的外源基因，也是肿瘤的克星。导入细胞后，“反义基因”的表达产物专门和肿瘤细胞的突变癌基因对抗，抑制它们的表达，使肿瘤消退，起到治疗作用；为了增强机体免疫系统对肿瘤细胞的识别、监视和杀伤能力，科学家们又把能激活免疫细胞活性的物质—细胞因子（如白细胞介素-2，干扰素等）的基因或组织相容性抗原的共刺激因子（如B7因子）的基因导入肿瘤细胞，它们的产物分泌出来后，可诱导和增强肿瘤组织周围的免疫细胞对肿瘤的杀伤效应；诸如此类的例子举不胜举。综上所述，广义的基因疗法是指将遗传物质（基因）导入载体或受体细胞，通过替代缺陷基因、修正错误基因、对抗异常基因、调节异常基因的表达等方式，使机体细胞恢复正常功能，以实现治疗疾病的目的，因该治疗方法主要是对基因进行操作，包括基因的分离、切割、连接、筛选、转移等，故又称基因疗法。基因疗法的问世，反映了人们在向疾病作斗争的过程中，继手术疗法、药物疗法、放射疗法等传统治疗方法之后的又一伟大的革命性创举。

将外源正常基因导入人体的方式有两种。一种称为“体内直接导入”（in vivo），另一种是“体外间接导入”（ex vivo）。这两种方式可概括在图6-1中。不管是哪一种方式都必须将用作治疗的基因先装在一节“载货车辆”——载体（vector）上，进行运输和导入。如果将装了货的载体直接注射到人体的血液、肌肉、皮下或肿瘤部位（靶部位），这些载体在体内进行“目标搜索”，进一步将其携带的治疗基因送到需要治疗的靶细胞中，这就是“体内直接导入法”。另一种方式则是先由医生从患者身上取出一部分细胞在体外进行培养，这些细胞可以是骨髓细胞、血液的淋巴细胞或肿瘤细胞等，视需要而定。然后，将装有治疗基因的载体与培养

图6-1　治疗基因导入人体的两种途径

的人体细胞混合，并将治疗基因导入细胞内。这种含有外源基因的细胞称为“基因转化细胞”，它们具有治疗潜能。最后，再把这些修饰过的细胞输回到患者体内，发挥体内治疗作用。两种方式的根本区别在于将外源基因导入细胞内的过程是在体外还是在体内进行。

具体地说，基因疗法又是如何进行操作的呢？这需要实验室和临床共同协作才能完成。而其中主要采用的是基因工程技术。现结合图6-2加以说明。整个治疗过程由四个主要环节组成，具体如下述。

（1）治疗基因的选择。治疗基因，指将要被导入的外源正常基因，又称目的基因。可根据患者的实际需要而确定和选择。如前面所说的小女孩缺乏ADA酶的基因，需要从外面转入正常ADA基因，那么，正常的ADA基因就是所选择的目的基因和治疗基因。在图6-2中，我们用黑色条块代表所选择的目的基因。

（2）构建基因载体。这是基因治疗中最重要的环节。形象地说，就是要千方百计地设法将目的基因稳当而又牢固地装在“运载车辆”——载体上。为了使外源基因在进入受体细胞后，能高效、可控、稳定的表达，发挥良好的治疗作用，对载体的要求相当高。理想的载体必须具备下列条件：①具有搜索目标的能力，知道该把车上的货（治疗基因）送到哪些细胞中去，即载体必须装备“定向器”的结构。②载体还必须有一整套控制系统，像“闸刀开关”一样，随时命令目的基因什么时候开始工作，什么时候停止工作。换句话说，载体上必须具备能够诱导、调节外源基因表达的整套元件（如启动子P、增强子、终止序列T等）。③载体必须使它所装载的外源基因的工作效率最高，也即我们必须着眼于构建一类高效表达载体。④载体上还必须有某些信号结构，像红绿灯一样，当载体进入细胞后，红灯亮，而外源基因表达时，绿灯也亮。用行话来说，就是载体必须含有筛选标志和标记基因。

外源基础表达的蛋白产物

图6-2　基因治疗操作顺序示意图

有了好的载体和目的基因后，就可以将两者联起来。由于目的基因在细胞内不是单独存在，而是和细胞所有的基因（又称基因组）连接成片的，这就需要先将基因组从细胞内提取出来，然后用核酸限制性内切酶（像一把专门剪切DNA分子的剪刀）切下来后，插入到载体分子上。载体分子实际上也是一种环状的、特殊的DNA分子，它含有供目的基因插入的位点，用同样的核酸内切酶在该位点处将其切开一个缺口，以供外源基因插入。外源基因和载体之间的连接是靠DNA连接酶来进行的（图6-2）。

（3）基因导入。是将含有外源基因的载体转移到细胞中的关键过程，此过程又称基因转染。一般有两种办法：一是物理方法，如磷酸钙沉淀法、脂质体包埋法、显微注射法和电穿孔法。此方法的主要缺点是转移效率低。二是生物法，常用修饰过的，不会致病的病毒作为外源基因的载体。我们都知道，病毒感染机体细胞的效率是非常高的，甚至可达100%。利用病毒的这个优点，再加以改造，“取其精华，去其糟粕”，制备成转基因的载体，真是一举两得了。常用的病毒有反转录病毒、腺病毒和疱疹病毒等。举例来说，艾滋病病毒属于反转录病毒，提到它，人们谈虎色变，可万万想不到，经过改造和修饰后，它还可以成为神经系统疾病基因治疗的非常理想的基因载体。

（4）受体细胞的选择。接受外源基因的细胞称为受体细胞。用于输回体内的受体细胞必须具备下述条件：易于获取和分离、适于体外培养，可以存活和增殖一定的时间、大量增殖它们的技术较完善。常用的有成纤维细胞、淋巴细胞、肝细胞或肿瘤细胞等，它们都是属于体细胞的范畴。

基因疗法可以在体细胞中进行，也可在生殖细胞中进行。体细胞的基因治疗一般不会影响后代的遗传性状。最适合进行体细胞基因治疗的是单基因缺陷的遗传病。如前面提到的凝血因子Ⅸ缺乏症和ADA缺乏症。目前已知单基因遗传病有3 000多种，而可治疗的已达20多种。生殖细胞的基因疗法是以生殖细胞中的缺陷基因为目标，一旦外源基因治疗成功，其后代也将会变成正常人，因而是一种彻底的基因疗法。但是，由于在生殖细胞中进行的遗传操作可以世世代代遗传下去，故在安全性和伦理问题上一直有很大的争议，操作中稍有不慎，所产生的错误将影响后代；加上生殖细胞的基因转染效率极低，目前很少进行。

掌握好上述四个环节，基因治疗前期工作准备就绪，可以进行临床试验治疗了。由于基因疗法是一种新的医疗技术，有一定的风险性，应在衡量安全性和临床疗效后予以实施。在美国，先要将治疗方案送NIll重组DNA咨询委员会（RAC）审查后再送食品与药物管理局（FAD），两处均通过后，才能实施方案。我国的审批机构则挂靠在卫生部药政司。审查的主要内容包括：预测疗效和潜在危险；临床治疗程序的质量；质量的最终目的与具体检测指标；副作用和潜在危险的检测指标；随防措施和治疗终末指征；癌症是否致命及替代疗法。FAD的审批重点在对用于基因治疗的生物制品的质量的鉴定与控制。

目前基因疗法的主要对象应是病情严重，预后极差，又没有常规有效治疗替代手段的一些疾病，当然，遗传病和肿瘤是首选对象。统计资料表明，仅1997年美国就有138万人被诊断为癌症，而传统的手术、化疗、放疗等措施治愈的还不到其中一半的人。因此，基因疗法作为一颗希望之星而被推向医学前沿，并在实践中不断完善。从1994年6月所备案的基因治疗统计资料来看，肿瘤的基因治疗占了69%，处于主导位置。除了遗传病和肿瘤外，艾滋病、心血管系统疾病和神经系统疾病也都是基因治疗可供选择的适应证。随着基础研究的进展和技术方法的进步，可进行基因治疗的病种范围将进一步扩大。

预计在21世纪，克服下述限制因素后，基因治疗会有重大突破。如超越目前基因治疗中所采用的瘤苗式的模式、外源基因的随机插入，是否会破坏调节细胞生长的基因而引起癌症或其他不可预料的后果、如何使外源基因能在所需要的组织中表达并且这种表达是可调节的等。上述问题解决需要实践，需要时间，但是科学家们充满信心，因为在目前，基因治疗还不是很完善的情况下，它已经显示出很好的苗头，经过不断的实践，它一定会前途灿烂似锦。

在我国，基因治疗的研究也提到日程上来。1992年10月在北京召开了第一次基因治疗国际会议，展示了国内外这个领域内的主要进展。同时在上海举行了遗传病分子生物学国际会议，并召开了基因治疗的专题讨论会，为我国开展基因治疗研究打下了基础。为在世界高科技发展的激浪中占有一席之地，我国的生物学和医学专家们不甘落后，也成功地将人凝血因子Ⅸ的基因装在反转录病毒载体中导入从患者身上取下来的、体外培养的成纤维细胞中，再将此含有导入基因的成纤维细胞经皮下注入患者体内，获得了Ⅸ因子的成功表达，取得了一定的治疗效果。相信，在不久的将来，也会捷报频传，让我们翘首以待吧！