血小板正常凝血就正常吗

第十章　弥散性血管内凝血（DIC）

实验目的

初步掌握复制家兔急性DIC动物模型的方法，讨论急性DIC的发病机制。

实验原理

耳缘静脉注入兔脑粉浸液，通过激活外源性凝血系统，导致DIC发生。

实验对象及相关用品

1.实验对象

家兔，雌雄不限，体重2.0～2.5kg。

2.实验相关用品

动物实验手术器械，试管架，试管，刻度离心管，离心机，BL-420生物机能实验系统，BI-2000微循环图像分析系统，3%戊巴比妥钠溶液，4%兔脑粉生理盐水浸液，3.8%枸橼酸钠溶液。

实验分组

对照组和实验组。

观测指标

（1）血小板计数：急性DIC时，血小板的消耗大于生成。

（2）凝血相关指标：①活化部分凝血活酶时间（APTT），凡是参与凝血活酶生成的任何因子缺陷时，APTT延长，如Ⅷ因子、Ⅸ因子、Ⅺ因子、Ⅻ因子缺乏，也见于Ⅴ因子、Ⅹ因子、凝血酶原、纤维蛋白原缺乏；②凝血酶原时间（PT），急性DIC时，PT时间延长；③血浆鱼精蛋白副凝实验（3P试验），在继发性FDP大分子碎片存在的DIC中，本实验阳性；④血浆纤维蛋白原含量，急性DIC时，纤维蛋白原明显减少。

（3）肠系膜微循环：急性DIC时，可见血细胞及血小板形态、血流速度变化，血栓形成，血浆外渗现象等。

实验步骤

1.实验组

（1）家兔称重，仰卧位固定在兔台上。

（2）3%戊巴比妥钠溶液（1mL/kg）经耳缘静脉注射行全身麻醉。

（3）剪去颈部手术视野的被毛，常规暴露气管，插气管插管，保持呼吸通畅；分离一侧颈总动脉，插入硅胶管，作取血样本用；分离另一侧颈总动脉，行颈总动脉插管并连于压力换能器，在BL-420生物机能实验系统上描记血压。

（4）在右侧腹直肌旁做长5～8cm的纵向中腹部切口，钝性分离肌肉，打开腹腔后，推开大网膜，找出一段游离度较大的小肠肠袢，从腹腔中拉出，放置在BI-2000微循环图像分析系统连接的微循环恒温灌流槽内，使肠系膜均匀平铺在有机玻璃观察环上，压上固定板，调整灌流液液面，使其刚刚覆盖过肠系膜。

（5）用BI-2000微循环图像分析系统于显微镜下观察肠系膜的正常微循环。记录正常状态下的血压。经颈动脉取血，将最先流出的数滴血弃之，然后于盛有3.8%枸橼酸钠溶液（0.5mL）的离心管中放入兔血4.5mL，上下颠倒混匀，请勿震荡。先取20μL供血小板计数用，其余血液离心15min（3000r/min），取血浆检测凝血相关指标。

（6）取4%兔脑粉生理盐水浸液，按2.0mL/kg计算，将总量用生理盐水稀释至30mL，由耳缘静脉注射（可用头皮静脉针），在15min内注完。其注入速度为：第一个5min以1.0mL/min注入；第二个5min以2.0mL/min注入；最后5min以3.0 mL/min注入。

（7）用BI-2000微循环图像分析系统于显微镜10×物镜下动态观察肠系膜的微循环；于40×物镜下观察微循环中血细胞及血小板形态、血流速度、血栓形成、血浆外渗现象等。

（8）分别于注射兔脑粉浸液开始后15min、45min记录血压变化，并由颈总动脉采集血样，检测血小板计数和凝血相关指标。

（9）实验结束后处死动物，打开胸腔、腹腔，观察各脏器的变化。

2.对照组

将耳缘静脉注入兔脑粉浸液改为注入等量生理盐水，注入途径、总量、速率、观察指标等均与实验组相同。

注意事项

（1）本实验中，兔脑粉浸液的制备及注射速度对实验成败影响较大。①兔脑粉浸液的制备：称取兔脑粉400mg，其活力（PT）不得大于12s，加入生理盐水10mL，充分搅匀后放入37℃恒温水浴内孵育60min，每隔15min充分搅拌一次，然后离心（1000r/min）5min，取上清液过滤后，供静脉注射用。或将兔脑凝血活酶冻干制剂稀释后静脉注入。②注入兔脑粉浸液的原则是先慢后快，切忌过快，否则极易造成动物猝死。注射过程中密切观察动物呼吸情况，必要时酌情调整注射速度。

（2）每次采集完血样用生理盐水冲洗动脉插管（5mL注射器）以防管内凝血。注意不能使用抗凝剂，以免影响实验结果。

（3）本实验中所用试剂、血浆样本及吸管较多，同一吸管只能吸取某一试剂或血浆样本，避免交叉使用。

（4）如室温低于20℃，实验用血浆应在37℃恒温水浴中保温1min。

实验报告要点

（1）实验目的明确，实验步骤清晰。

（2）实验结果记录完整、准确。

（3）围绕实验结果展开讨论。

（4）总结实验中的经验、教训。

思考题

1.试分析本实验动物发生DIC的可能机制。

2.综合分析实验结果，你所复制的模型属于DIC的哪个期？并说明原因。

附：

1.血小板计数及凝血相关指标的检测方法

（1）血小板计数：吸取血小板稀释液0.38mL于一试管内，用血红蛋白吸管取血20μL立即加入血小板稀释液中，充分混匀后，用滴管将上述混悬液1小滴滴入计算室内，静置15min，用高倍镜计数。数5个中方格内的血小板数×10⁹/L。

（2）活化部分凝血活酶时间（APTT）。

①原理：以脑磷脂代替血小板磷脂，白陶土为活化剂，使因子Ⅹ、Ⅺ充分活化，与血浆混合，温育一定时间使凝血因子活化，然后加入氯化钙测定血浆凝结时间。

②方法：将被检血浆0.2mL加入小试管内，置37℃水浴中，再加入白陶土部分凝血活酶试剂（K试液）0.2mL，混匀，孵育3min；加入0.025mol/L氯化钙溶液0.2mL，同时开动秒表，30s后将试管从水浴中取出，倾斜试管，直至液体停止流动（呈胶冻状）或出现白色粗颗粒，即为凝固终点。重复操作2～3次，取平均值。正常参考值约30s。

（3）凝血酶原时间（PT）。

①原理：血浆中加入过量的组织凝血活酶与适量的钙离子，观察其凝固时间，据此可以估计血浆中凝血酶原复合物（因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ）的水平。它是外源性凝血系统基本的筛选实验。

②方法：取被检血浆0.1mL加入小试管内，置37℃水浴中，再加入P试液0.2mL，开动秒表，观察方法同上，测定凝固时间。重复操作2～3次，取平均值。正常参考值为6～8s。

（4）血浆鱼精蛋白副凝实验（3P试验）。

①原理：鱼精蛋白可分离FDP与纤维蛋白单体结合的可溶性复合物使纤维蛋白单体聚合沉淀，呈现纤维丝条。

②方法：被检血浆0.45mL置于小试管内，37℃水浴3min，再向小试管内加入1%鱼精蛋白液0.5mL，37℃水浴15min或室温30min，将小试管轻轻摇动，置明亮的光源下，观察有无不溶解物质，必要时可用放大镜观察。有白色纤维或凝块为阳性，均匀浑浊、无白色纤维者为阴性。

（5）血浆纤维蛋白原含量（热沉淀比浊法）。

①原理：血浆经pH值为6.3的缓冲液稀释后置于56℃水浴15min，纤维蛋白原被沉淀而呈现浊度，而其他蛋白质仍处于溶解状态，于405nm波长比浊测定，在一定范围内，纤维蛋白原（包括无功能的纤维蛋白原、纤维蛋白原降解产物）含量与浊度成正比。

②方法：取3支试管，分别为空白管、实验管、对照管，按表10-1操作。

表10-1　血浆纤维蛋白原含量的测定

将各试管内液体旋转混匀。用722分光光度计（波长405nm），1cm比色杯，以空白管调零，读取第一次吸光度值为A₁，然后3管同置56℃水浴15min，冷却至室温，读取第二次吸光度值为A2。

A₂-A₁＝ΔA，查校正曲线得结果。

校正曲线的制作：将已知定量血浆配成1.0g/L、2.0g/L、4.0g/L、6.0g/L、8.0g/L溶液，按上述操作，求ΔA，作标准曲线。在8.0g/L范围内呈线性。

2.试剂配制

（1）K试液：实验前将2%白陶土生理盐水悬液1份与兔脑磷脂悬液等量混合，作KPTT测定用。

（2）P试液：实验前称取200mg兔脑粉，加入5mL生理盐水，充分混匀后于37℃恒温水浴1h。在此过程中，间歇用玻棒搅拌3～4次，并颠倒混匀，然后离心（1000r/min）5min，吸取上清液，加入等量的0.025mol/L氯化钙溶液，用前摇匀，作PT测定用。

（3）KH2PO₄-NaOH缓冲液（pH值6.3）：0.1mol/L KH2PO₄50mL加0.1mol/L NaOH 10.6mL混合，加蒸馏水至100mL。

（吉林大学白求恩医学院　李扬）