家兔急性肾功能衰竭

第一节　家兔急性肾功能衰竭

实验目的

（1）复制中毒性肾功能不全模型。

（2）通过测定血尿素氮水平，酚红排泄率测定，尿蛋白的变化，内生肌酐清除率及肾脏的形态学改变，了解汞中毒对家兔肾脏功能的影响。

（3）根据实验指标判断并分析讨论急性肾功能衰竭的发病机制及其病理生理变化。

实验原理

急性肾功能衰竭是由急性肾缺血、肾中毒等引起的在短时间内肾功能进行性下降的临床综合征。通过使用氯化汞（HgCl₂）致使动物肾小管变性坏死，复制急性肾功能不全的动物模型。观察动物血尿素氮、尿液成分的变化，酚红排泄率测定及内生肌酐清除率的变化，加深对急性肾功能衰竭时内环境变化的理解。

实验对象及相关用品

1.实验对象

家兔两只，体重为1.5～2.5kg。

2.实验相关用品

（1）实验器械：婴儿秤，兔固定台，手术器械一套，注射器（1mL、5mL），试管，滴管，吸管，试管夹，试管架，酒精灯，动脉夹，膀胱漏斗，离心机，水浴锅，分光光度计，量筒（500mL）1个，显微镜。

（2）药品与试剂：1%HgCl₂，0.9%Nacl溶液，20%乌拉坦溶液，5%葡萄糖溶液，20%葡萄糖溶液，0.2%肝素钠溶液，5%醋酸溶液，酸混合液，尿素氮标准液Ⅱ，二乙酰-肟-氨硫脲（DAM-TSC）液，肌酐标准应用液，苦味酸，0.6%酚红溶液，10%NaOH溶液。

实验分组

本实验分为两组，正常对照组和中毒实验组。

观测指标

1.记录尿量，进行尿蛋白定性及尿沉渣显微镜检查

（1）尿蛋白定性实验：取正常及中毒家兔尿液各约3mL分别放入试管中，以试管夹夹住试管，倾斜试管于酒精灯上，将试管中的尿液加热至沸腾（试管口不要对着人，小心加热，切勿让试管内尿液溢出）。观察尿液有无混浊，若有混浊，加入5%醋酸溶液3～5滴，再煮沸，若尿液变清，则是尿液中尿酸盐所致；若混浊加重，则表示尿中含有蛋白，根据其混浊程度可按下面标准判断结果。

“-”表示尿液清晰不混浊。

“＋”表示尿液出现轻度白色混浊（含蛋白质0.01g%～0.05g%）。

“＋＋”表示尿液呈现稀薄乳样混浊（含蛋白质0.05g%～0.2g%）。

“＋＋＋”表示尿液混浊或有少量絮片存在（含蛋白质0.2g%～0.5g%）。

“＋＋＋＋”表示尿液中出现絮状混浊（含蛋白质大于0.5g%）。

如加醋酸后混浊消失，则因醋酸可除去磷酸盐或碳酸盐所形成的白色混浊。

（2）尿液显微镜检查：

①将收集的实验组和对照组家兔的尿液取出一滴置于玻片上，于显微镜下细胞计数，至少检查10个高倍视野，管型至少检查10个低倍视野，用最低至最高数报告；

②也可取一定尿液分别置于两支离心管中离心沉淀（1500r/min，5～10min），取尿沉渣涂片先低倍后高倍镜观察，计算10个不同视野管型和细胞的近似平均值，其中管型以低倍视野计算，细胞以高倍视野计算。

2.血浆尿素氮测定

（1）操作方法：见表15-1，将上述各管充分混匀，置沸水浴锅中煮沸15min，置流水中冷却3min，在540nm波长下比色以空白调零（或用蒸馏水空白调零），记录标准管的光密度读数（D标）及样品管的光密度读数（D样）。

表15-1　血浆尿素氮测定

注：测定管A为正常家兔血浆，测定管B为中毒家兔血浆。

（2）计算：

（3）原理：血液和尿液中的尿素在强酸条件下与二乙酰-肟-氨硫脲煮沸，生成红色复合物（二嗪衍生物）。从2只家兔颈总动脉各取血10mL，抗凝，离心20min（3000 r/min），分离血浆，用滴管将血浆吸出，分别移入小试管中备用。

3.血、尿肌酐测定和内生肌酐清除率的计算

从颈总动脉取血置于盛有肝素的离心管内，离心后取血浆，血浆和尿液各用蒸馏水1∶100稀释。按表15-2进行实验。

表15-2　血浆和尿液肌酐含量测定

加完上述试剂后混匀，置37℃水浴20min，再放到冷水盆中冷却约1min，在540nm波长处各以其相应的空白管调零，比色测定各管的光密度。本实验所需试剂宜在使用前两周内配制，逾期则苦味酸颜色加深，光密度值随之增高，影响检测结果。苦味酸具有爆炸性，配制该试剂时应先在容器内加少许蒸馏水，以防意外。

计算：

4.酚红排泄率测定

耳缘静脉注射0.6%酚红溶液（1mL/kg），接着注射20%葡萄糖溶液（10～20 mL/kg），收集从开始注射酚红起15min后的尿液，记录单位时间的尿量。将收集的尿液倒入500mL量筒内，加10%NaOH 10mL，用自来水补充至500mL处。混匀后，取出适量移入与标准管口径相同的试管内与标准管比色，得出15min或30min内肾脏酚红排泄率。

5.肾形态学观察

（1）实验最后，将家兔一并处死（放血或气栓），取出双侧肾脏称重，计算肾脏重量与体重之比。

（2）比较两组家兔肾脏外形、颜色、光泽及纵向剖开肾脏，观察两兔皮质、髓质条纹及色泽等。

（3）组织切片示教：在显微镜下观察皮质肾小管上皮有无变性、坏死、脱落等改变，管腔内有无蛋白及红、白细胞管型存在。

实验步骤

1.复制模型

取家兔两只，一只为正常对照组，另一只为中毒实验组。于实验前一天称重后，实验组家兔皮下或肌内注射1%HgCl₂溶液（1.5～1.7mL/kg，一次注射），造成急性中毒性肾功能衰竭模型，对照组家兔则在相同部位注射等量的生理盐水，作为对照。两只家兔实验前均喂少量蔬菜。

2.麻醉与固定

家兔称重后，腹腔注射20%乌拉坦（5mL/kg），将实验兔仰卧位固定于兔手术台上，耳缘静脉注射5%葡萄糖溶液（15mL/kg，5min内注完）以保证有足够的尿量。

3.腹部手术

下腹部剪毛，在耻骨联合上缘1.5cm处做长约4cm的正中切口，分离皮下组织，沿腹白线切开腹膜，将膀胱翻出腹外，辨认清楚输尿管，并向肾侧仔细分离两侧输尿管2～3cm，在其下方穿一条线，将膀胱上翻用线结扎膀胱颈部（即尿道内口）以阻断它同尿道的通路，然后在膀胱顶部选血管较少处，做一环形的荷包缝合，缝合线两端要足够长，暂不结扎；在荷包缝合的中央剪一纵行小切口，插入膀胱插管，然后用荷包缝合线将切口边缘固定于膀胱插管的橡胶上。收集1h尿液备用，并换算成每分钟尿量。

4.颈部手术

颈部做正中切口（5～7cm），暴露气管，在甲状软骨下约1cm处做倒“T”形切口，插入气管插管，分离左侧颈总动脉约2cm，于分离的颈总动脉远心端和近心端分别穿线备用，用于动脉插管。向动脉插管内注入0.2%肝素钠溶液，结扎左侧颈总动脉远心端，近心端用动脉夹夹闭。在结扎处的近心端一侧用眼科剪剪一斜口（剪口应尽量靠近结扎线，剪刀与颈总动脉纵轴成30°～45°角，剪开血管周径的1/3～1/2），向心脏方向插入已注满0.2%肝素钠溶液的动脉插管，进入约1cm，将血管及插管结扎牢固，并在结扎线的上方打结固定，以防滑脱。保持动脉插管与动脉在同一直线上，然后用胶布将动脉插管固定在手术台上。

注意事项

（1）尿液收集应尽量避免蒸发，以影响数据的准确性。

（2）暴露膀胱的手术操作应轻柔，防止刀片划破膀胱造成尿液外溢。

（3）边采血边摇动，防止凝血。

（4）煮沸及冷却时间应准确，否则颜色反应消退。

（5）实验前应给兔子多喂青菜，或在麻醉后立即给动物进行适量的输液，以增加其基础尿量。

（6）避免损伤动、静脉，严防出血。如发现有出血现象，必须立即止血。

（7）试验中需多次静脉注射。应注意保护兔的耳缘静脉。注射时，先从末梢端开始，逐渐向耳根端移近；或选用小儿头皮针刺入耳缘静脉，用胶布固定。用生理盐水维持使形成一静脉通路以便于多次注射使用。

（8）试管、吸管等器材要求清洁，血清、尿液标本和标准液等试剂量必须准备。所有操作均应按生化要求严格进行。

实验报告要点

（1）完整填写实验报告有关项目，字迹规整，文字简练。

（2）简明扼要写出本次实验的目的，如如何复制动物模型、观察哪些指标及要达到什么预期目的等。

（3）实验结果可使用表格表述，配以简洁的文字描述。

思考题

1.根据什么判断急性肾功能衰竭模型复制成功？

2.各项指标变化的机制是什么？

3.急性肾功能衰竭组与对照组动物的尿量有何差别？为什么？

4.二组实验动物的尿蛋白定性及尿沉渣显微镜检查结果有何不同？为什么？

5.急性中毒性肾功能衰竭动物的肾脏有哪些形态学变化？

6.急性中毒性肾功能衰竭时尿素氮含量改变是怎样发生的？